مقایسه تکنیک توالی‌یابی سنگر و توالی‌یابی نسل بعد (NGS)

در حال حاضر، دو روش محبوب توالی‌یابی DNA، توالی‌یابی سنگر و توالی‌یابی نسل بعد می‌باشند. امروزه تکنیک NGS تا حد زیادی از توالی‌یابی سنگر پیشی گرفته‌است، ولی تکنیک سنگر به دلیل سادگی و سهولت استفاده، هنوز هم توسط محققان مورد استفاده قرار می‌گیرد.

توالی‌یابی سنگر در دهه 1970 توسط فردریک سنگر توسعه یافت و در آن زمان روش اصلی تعیین توالی DNA بود.در توالی‌یابی سنگر، بازهای نوکلئوزیدی پایان‌دهنده زنجیره در واکنش همانندسازی DNA گنجانده می‌شوند، و منجر به تولید یک سری از زنجیره‌های DNA کوتاه شده، می‌شوند. سپس با جدا کردن این زنجیره‌ها به وسیله ژل پلی‌آکریل‌آمید توالی DNA تعیین می‌شود.

تکنیک توالی‌یابی نسل بعد روش جدیدتری است که می‌تواند برای تعیین توالی قطعات بسیار بزرگ DNA یا حتی ژنوم کامل استفاده شود. این تکنیک بر اساس توالی‌یابی در طی واکنش سنتز DNA می‌باشد. واکنش سنتز بر روی یک سطح ثابت انجام می‌شود. هر بار که یک باز اضافه می‌شود، توالی جدید خوانده می‌شود. در این روش هزاران واکنش سنتز می‌توانند همزمان انجام شوند و توالی DNA آن‌ها تعیین شود.

ایلومینا ( illumina )

پلت‌فرم غالب تکنیک توالی‌یابی نسل بعدی Illumina است. این تکنیک، توسط شرکت Solexa بر اساس فناوری ردیف‌بندی کردن و تقویت اتصال ، تحت نظر Pascal Meyer و همکارانش توسعه یافت، سپس توسط دانشمندان Solexa بهبود یافت. این فناوری در سال 2007 توسط شرکت ایلومینا خریداری شد.

روش ایلومینا محتوایی مشابه با روش توالی‌یابی سنگر دارد. در توالی‌یابی سنگر، دی‌دئوکسی‌نوکلئوزیدتری‌فسفات‌هایی ( ddNTPs ) که پایان‌دهنده زنجیره در طول تکثیر DNA هستند، در طول واکنش سنتز DNA الگو به آن اضافه می‌شوند، واکنش سنتز DNA با استفاده از یک آغازگر و یک DNA الگو انجام می‌شود.

در توالی‌یابی Illumina، پایان‌دهنده‌های ( ترمیناتورهای) برگشت‌پذیر به دئوکسی‌نوکلئوزیدتری‌فسفات‌های معمولی ( dNTPs ) متصل می‌شوند. پایان‌دهنده (ترمیناتور) گسترش زنجیره DNA را مسدود می‌کند.با این حال، ترمیناتورها برگشت پذیر هستند، بنابراین پس از بازخوانی، ترمیناتور حذف شده و باز دیگری به زنجیره اضافه می‌شود. سپس چرخه برای خواندن کامل قطعه تکرار می‌شود.

تشخیص

در توالی‌یابی سانگر، زنجیره‌های پایان‌یافته روی یک ژل پلی‌آکریل‌آمید از یکدیگر جدا می‌شوند. پرایمرها ( dNTPs ) با یک ایزوتوپ رادیواکتیو یا معمولاً یک برچسب فلورسنت نشاندار می‌شوند. سپس توالی یک بار به طور کامل خوانده می‌شود. به کمک فلورسانس و با استفاده از چهار رنگ مختلف فلورسنت ، بازهای مختلف تشخیص داده می‌شوند.

در تکنیک توالی‌یابی Illumina، تشخیص با استفاده از یک برچسب فلورسنت متصل به dNTP انجام می‌شود. یک رنگ فلورسنت برای همه بازها استفاده می‌شود و هر dNTP به طور جداگانه اضافه می‌شود، به این ترتیب می‌توان آن‌ها را از یکدیگر متمایز کرد.

توالی‌یابی DNA

تفاوت عملی اولیه بین توالی یابی‌سنگر و توالی‌یابی نسل بعدی، محصول داده‌های توالی است.

دستگاه توالی یابی Illumina توانایی توالی‌یابی 20 مگا باز ( Mb ) در ساعت با طول خواندن 100 باز از هر دو انتهای رشته الگو را دارد. قدرت توالی‌یابی سنگر بر روی قطعه ژل، 0672/0 مگاباز در ساعت با طول خواندن 700 جفت باز می‌باشد.

هزینه

هزینه نسبی توالی یابی سنگر بیشتر از NGS است. طبق مطالعه‌ای در سال 2011، هزینه تکنیک توالی‌یابی سنگر حدود 500 دلار در هر 1000 باز تخمین زده‌شد، در حالی که کمتر از 50/0 دلار هزینه برای هر 1000 باز در روش NGS مصرف می‌شود.

زمان استفاده از توالی سنگر

تکنیک توالی‌یابی نسل بعدی اکنون برای تحقیقات خاصی ترجیح داده می‌شود. آن‌ها عبارتند از: