تکنولوژی CRISPR-Cas9 در ویرایش ژنوم

مقدمه‌ای بر تکنولوژی CRISPR-Cas9 در ویرایش ژنوم

ویرایش ژنوم نوعی مهندسی ژنتیک است که در آن DNA عمدتا در سلول‌های زنده وارد، حذف یا اصلاح می‌شود. نام CRISPR به سازمان‌دهی منحصربه‌فرد توالی‌های DNA کوتاه و تا حدی تکرار شده در سلول‌های زنده اشاره دارد.

ژنوم پروکاریوت ها CRISPR و پروتئین مرتبط با آن  Cas-9 روشی برای ایمنی تطبیقی ​​در پروکاریوت‌ها برای دفاع از خود در برابر ویروس‌ها یا باکتریوفاژها است. دانشمند ژاپنی ایشینو و تیمش به طور تصادفی در حین تجزیه و تحلیل یک ژن، توالی‌های DNA پالندرومیک تکراری غیرمعمول را پیدا کردند که توسط spacer در اشریشیا کلی قطع می‌شوند.

برای آلکالین فسفاتاز اولین بار CRISPR را در سال 1987 کشف کردند. با این حال، آنها عملکرد بیولوژیکی آن را مشخص نکردند. در سال 1990، فرانسیسکو موجیکا توالی‌های مشابهی را در سایر پروکاریوت‌ها شناسایی کرد و CRISPR را نام برد، اما عملکرد این توالی‌ها یک راز بود. بعدا در سال ۲۰۰۷، یک CRISPR به طور تجربی به عنوان یک عنصر کلیدی در سیستم ایمنی تطبیقی ​​پروکاریوت‌ها در برابر ویروس‌ها معرفی شد.

در طول فرآیند سازگاری، سلول‌های باکتریایی با قرار دادن قطعات کوتاه DNA ویروسی در ناحیه ژنومی به نام آرایه CRISPR ایمن می‌شوند. از این رو، spacer ها به عنوان حافظه ژنتیکی عفونت های ویروسی قبلی عمل می کنند.

مکانیسم دفاعی CRISPR از باکتری ها در برابر حملات مکرر ویروسی از طریق سه مرحله اصلی محافظت می کند: سازگاری (spacer acquisition)، سنتز crRNA (بیان)، و تداخل هدف.

جایگاه های کریسپر آرایه ای از توالی های کوتاه مکرر هستند که در DNA کروموزومی یا پلاسمید پروکاریوت ها یافت می شوند. ژن Cas معمولا در مجاورت CRISPR یافت می شود که پروتئین نوکلئاز (پروتئین Cas) را که مسئول تخریب یا جدا کردن نوکلئیک اسید ویروسی است کد می کند.

قبل از کشف CRISPR-Cas9، دانشمندان بر دو تکنیک ویرایش ژنی با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده، انگشت روی (ZFN) و نوکلئازهای موثر فعال‌کننده رونویسی (TALENs) تکیه می کردند. ZFN دارای دامنه اتصال DNA انگشت روی است که برای اتصال یک توالی DNA هدف خاص و یک دامنه اندونوکلئاز محدود که برای جدا کردن DNA در محل هدف استفاده می شود.

TALEN ها همچنین از دامنه اتصال DNA و دامنه محدود مانند ZFN تشکیل شده اند، اما دامنه اتصال DNA آنها نسبت به ابزار ویرایش ژن ZFN توالی هدف بالقوه بیشتری دارد. در هر دو مورد، دشواری مهندسی پروتئین، گران بودن و زمان‌بر بودن چالش‌های اصلی برای محققان و تولیدکنندگان بود.

توسعه یک روش قابل اعتماد و کارآمد از ابزار ویرایش ژن در سلول‌های زنده مدت طولانی هدف محققان زیست پزشکی بوده است. پس از کشف مکانیسم CRISPR در پروکاریوت ها، دانشمندان دریافتند که می تواند برای انسان، گیاهان و سایر میکروب ها کاربرد مفیدی داشته باشد. در سال 2012 بود که Doudna، J، و Charpentier، E  کشف کردند که CRISPR-Cas-9 می تواند برای ویرایش هر DNA دلخواه فقط با ارائه الگوی مناسب مورد استفاده قرار گیرد و روشی دقیق برای ویرایش ژنوم در تمام سلول‌های زنده و در بسیاری از رشته‌های کاربردی می باشد.

اجزای CRISPR-Cas-9

بر اساس ساختار و عملکرد Cas-proteins، سیستم CRISPR-Cas را می توان به کلاس I (نوع I، III و IV) و کلاس II (نوع II، V و VI) تقسیم کرد. سیستم‌های کلاس I از کمپلکس‌های پروتئین Cas-protein چند زیر واحدی تشکیل شده‌اند، در حالی که سیستم‌های کلاس II از یک Cas-protein منفرد استفاده می‌کنند.

از آنجایی که ساختار نوع II CRISPR-Cas9 نسبتا ساده است، به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته و به طور گسترده در مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار گرفته است. پروتئین Cas-9، اولین پروتئین Cas مورد استفاده در ویرایش ژنوم از استرپتوکوک پیوژنز (SpCas-9) استخراج شد. این یک اندونوکلئاز DNA چند دامنه ای بزرگ (1368 اسید آمینه) است که مسئول شکافتن DNA هدف برای تشکیل یک شکست دو رشته ای است و قیچی ژنتیکی نامیده می شود.

Cas-9 از دو ناحیه تشکیل شده است که به آن لوب تشخیص (REC) و لوب نوکلئاز (NUC) می گویند. لوب REC از دامنه‌های REC1 و REC2 تشکیل شده است که مسئول اتصال RNA راهنما هستند، در حالی که لوب NUC از حوزه‌های تعاملی RuvC، HNH و Protospacer Motif مجاور (PAM) تشکیل شده است. دامنه‌های RuvC و HNH برای برش هر DNA تک رشته‌ای استفاده می‌شوند، در حالی که دامنه تعاملی PAM ویژگی PAM را اعطا می‌کند و مسئول شروع اتصال به DNA هدف است.

RNA راهنما از دو بخش CRISPR RNA (crRNA) و trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) ساخته شده است. crRNA یک جفت باز ۱۸ تا ۲۰ است که DNA هدف را با جفت شدن با توالی هدف مشخص می کند، در حالی که tracrRNA یک امتداد طولانی از حلقه ها است که به عنوان داربست اتصالی برای نوکلئاز Cas-9 عمل می کند. در پروکاریوت‌ها، RNA راهنما برای هدف قرار دادن DNA ویروسی استفاده می‌شود، اما در ابزار ویرایش ژن، می‌توان آن را با ترکیب crRNA و tracrRNA برای تشکیل یک RNA راهنمای واحد (sgRNA) طراحی کرد تا تقریبا هر توالی ژنی را هدف قرار دهد.

کاربردهای CRISPR-CAS-9

ابزار ویرایش ژنوم CRISPR-Cas-9 تنها در چند سال پس از کشف خود، در حال حاضر برای تعداد زیادی از کاربردها مورد بررسی قرار گرفته است و تأثیر گسترده ای بر جهان در بسیاری از زمینه ها از جمله پزشکی، کشاورزی و بیوتکنولوژی داشته است. در آینده، محققان امیدوارند که این فناوری برای درمان بیماری‌ها، توسعه محصولات مغذی‌تر و ریشه‌کن کردن بیماری‌های عفونی به پیشرفت خود ادامه دهد.

نقش CRISPR-CAS9 در ژن درمانی

بیش از 6000 اختلال ژنتیکی تاکنون شناخته شده است. اما اکثر بیماری ها فاقد استراتژی های درمانی موثر هستند. ژن درمانی فرآیند جایگزینی ژن معیوب با DNA اگزوژن و ویرایش ژن جهش یافته در محل اصلی آن است. این آخرین پیشرفت در انقلاب بیوتکنولوژی پزشکی است. از سال 1998 تا آگوست 2019، 22 ژن درمانی از جمله CRISPR-Cas-9 جدید برای درمان بیماری های انسانی تایید شده است.

از زمان کشف آن در سال 2012، ویرایش ژن CRISPR-Cas-9 نوید درمان بسیاری از بیماری های ژنتیکی شناخته شده مانند بیماری سلول داسی شکل، بتا تالاسمی، فیبروز کیستیک و دیستروفی عضلانی را داده است. CRISPR-Cas9 برای درمان بیماری سلول داسی هدفمند (SCD) و بتا تالاسمی نیز در کارآزمایی‌های بالینی استفاده شده است.

SCD یک بیماری ژنتیکی اتوزومال مغلوب سلول‌های قرمز خون است که به دلیل جهش نقطه‌ای در زنجیره β گلوبین هموگلوبین منجر به بروز می‌شود. هموگلوبین داسی (HbS) در طی فرآیند اکسیژن‌زدایی، پلیمریزاسیون HbS منجر به عوارض بالینی شدیدی مانند کم‌خونی همولیتیک می‌شود. ترمیم مستقیم ژن هموگلوبین S یا تقویت γ-گلوبین جنینی دو رویکرد اصلی هستند که CRISPR-Cas-9 برای درمان SCD استفاده می شود.

با این حال، رایج ترین روش مورد استفاده در کارآزمایی بالینی مبتنی بر رویکرد افزایش هموگلوبین جنین است. ابتدا سلول‌های مغز استخوان از بیماران برداشته می‌شوند و ژنی که تولید هموگلوبین جنینی را متوقف می‌کند، به نام لنفوم سلول B (BCL11A) با CRISPR-Cas9 غیرفعال می شود. سپس، سلول های ویرایش شده توسط ژن دوباره به بدن تزریق می شوند.

BCL11A یک ژن ۲۰۰ جفت بازی است که در کروموزوم ۲ یافت می شود و محصول آن مسئول تبدیل γ گلوبین به زنجیره β گلوبین با سرکوب بیان ژن γ گلوبین است. هنگامی که این ژن با استفاده از CRISPR-Cas-9 غیرفعال می شود، تولید هموگلوبین جنینی حاوی γگلوبین در گلبول های قرمز افزایش می یابد و در نتیجه شدت و تظاهر SCD را کاهش می دهد.

دانشمندان همچنین CRISPR-Cas-9 را برای درمان فیبروز کیستیک بررسی کرده اند. جهش ژنتیکی ژن تنظیم کننده هدایت غشایی گذرنده فیبروز کیستیک (CFTR) ثبات ساختاری و عملکرد پروتئین CFTR را کاهش می دهد که منجر به فیبروز کیستیک می شود. پروتئین CFTR یک پروتئین کانال آنیونی است که توسط پروتئین کیناز A تنظیم می شود و در سطح آپیکال اپیتلیال سلول‌های ریه، روده، لوزالمعده و دستگاه تناسلی قرار دارد.

نقش درمانی CRISPR-Cas-9

اولین درمان مبتنی بر CRISPR در آزمایش انسانی برای درمان بیماران مبتلا به سرطان ریه مقاوم به درمان انجام شد. محققان ابتدا سلول‌های T را از خون سه بیمار استخراج کردند و آنها را در آزمایشگاه از طریق CRISPR-Cas-9  برای حذف ژن‌هایی که در مبارزه با سلول‌های سرطانی دخالت می‌کنند، مهندسی کردند.

سپس سلول های T اصلاح شده را به بیماران تزریق کردند. سلول های T اصلاح شده می توانند آنتی ژن های خاص را هدف قرار دهند و سلول های سرطانی را از بین ببرند. در نهایت، هیچ عارضه جانبی مشاهده نشد و سلول‌های T مهندسی شده را می‌توان تا 9 ماه پس از انفوزیون شناسایی کرد. فناوری ویرایش ژن CRISPR-Cas9 همچنین می‌تواند برای درمان بیماری‌های عفونی ناشی از میکروارگانیسم‌ها استفاده شود.

نقش در کشاورزی

با ادامه رشد جمعیت جهان، خطر کمبود منابع کشاورزی واقعی است. از این رو، نیاز به فناوری های جدید برای افزایش و بهبود تولید مواد غذایی طبیعی احساس می شود.

CRISPR-Cas9 افزودنی موجود در این زمینه است زیرا برای اصلاح ژنتیکی غذاها به منظور بهبود ارزش غذایی آنها، افزایش ماندگاری آنها، مقاوم کردن آنها به خشکی و افزایش مقاومت در برابر بیماری استفاده شده است. به طور کلی سه راه وجود دارد که CRISPR در حال حل بحران غذایی جهان است. می تواند منابع غذایی را بازیابی کند، به گیاهان کمک کند در شرایط تنش های مختلف زنده بمانند و می تواند سلامت کلی گیاهان را بهبود بخشد.

مطالب مرتبط:

• دوره مهارت آموزی ژن درمانی
• دوره مهارت آموزی طراحی دارو