تکنیک ها، میکروبیولوژی، ویدیو های آموزشی
تکنیک کلنی کانت
کلنی کانت چیست؟ تکنیک کلنی کانت
شمارش سلول ها یا کلنی کانت یکی از فرآیندهای متعدد در زیست شناسی می باشد که در عمل تعدلد سلول ها در حجم مشخص شمارش می شود. هنگامی که تعداد سلول ها در یک حجم مشخص شمارش می شود، از این طریق می توان به غلظت سلول ها دست یافت. از روی غلظت سلول های باکتریایی و یا ویروسی می توان در رابطه با بیماری های مزمن و چگونگی مقابله بدن با آن عفونت، اطلاعات مفیدی بدست آورد. از این رو انجام کلنی کانت در آزمایشات میکروبی حائز اهمیت می باشد. با استفاده از هموسایتومتر و یا محفظه ی شمارش می توان شمارش مستقیم انجام داد.
هموسایتومتر با تقسیم یک حجم مشخص به مکعب هایی با اندازه های متفاوت می توان تعداد ذرات موجود در یک مکعب را به طور دقیق شمارش نمود و در نهایت غلظت کل نمونه را محاسبه نمود. با فرض توزیع صحیح سلول ها در یک محیط کشت، می توان هر سلول را یک کلونی در نظر گرفت. از آنجایی که کلونی ها قابل شمارش هستند و حجم محیط کشت موجود در پلیت نیز مشخص می باشد، می توان غلظت سلول ها را محاسبه نمود.
قابل ذکر می باشد که شمارش کلونی های باکتریایی با استفاده از سری رقت های باکتریایی انجام می شود. در صورتی که کشت ها قبل از کلونی کانت رقیق نشوند، کلونی ها مجزا و قابل تفکیک از همدیگر نمی باشند که در این صورت عملا تکنیک کلنی کانت غیر ممکن می شود. روش شمارش مستقیم از آنجایی که نیازمند ابزار دقیقی نمی باشد، در اکثر آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرد. نکته ی حائز اهمیت در ارتباط با روش پلیت کردن این است که این روش روش کندی می باشد چرا که اکثر میکروارگانیسم ها برای تشکیل کلنی که قابل مشاهده باشد به حداقل 12 ساعت نیاز دارند.
شمارش کلونی
یکی از روش‌های کلاسیک برای تعیین غلظت میکروب‌ها در نمونه، رقیق کردن نمونه، رشد میکروب‌ها در پلیت‌ها و شمارش کلنی‌ها است. میکروب‌های موجود در پلیت از یک واحد تشکیل دهنده کلنی متشکل از یک یا چند سلول به یک کلنی آشکار که قابل مشاهده و شمارش است رشد می‌کنند. باکتری‌ها رایج ترین میکروبی هستند که با استفاده از شمارش پلیت ارزیابی می‌شوند. شمارش کلونی برای شناسایی و شمارش میکروب‌ها در خاک، آب و غذا استفاده می‌شود. پروتکل‌های شمارش کلونی بر رویکرد دقیق و هدفمند تأکید دارند.
رقیق کردن نمونه‌ها، کشت دادن و انکوبه کردن
اگر به سادگی یک نمونه میکروبی را روی یک پلیت آگار کشت دهید، تعداد زیادی واحد تشکیل دهنده کلنی خواهید دید که کلنی‌های جداگانه با هم ترکیب می شوند و شمارش آنها غیرممکن می‌شود. برای حل این مشکل، نمونه را در یک محیط مایع میکس کنید، مقدار کمی از آن مخلوط را بردارید و آن را بیشتر رقیق کنید. این عمل را شش تا 10 بار تکرار کنید. رقت نهایی را روی یک صفحه آگار پخش کنید و آن را به مدت چهار تا هفت روز قبل از شمارش کلنی‌ها در انکوباتور قرار دهید.
شمارش دستی
ترفند اصلی در شمارش کلنی‌ها این است که هر نقطه کلنی را یک بار بشمارید. یک روش به این صورت است که ظرف پتری را روی یک پس‌زمینه شبکه‌ای قرار می‌دهید و کلنی‌ها را در هر سلول شبکه شمارش می‌کنید و در یک الگوی مشخص در تمام سلول‌های شبکه حرکت می‌کنید. علامت گذاری کلنی‌های شمارش شده در پشت ظرف پتری نیز می تواند یک عمل مفید باشد. به طور کلی، شما باید حداقل سه پلیت را بشمارید. پیشنهاد می شود که فقط از پلیت‌های حاوی 30 تا 300 کلنی برای استنتاج قوی استفاده کنید. پلیت‌ها با کلنی‌هایی که تعداد آنها بسیار زیاد است یا تعداد آنها بسیار کم است باید از یک رقت جدید دوباره در پلیت کشت داده شوند.
شمارش خودکار
خطای انسانی به زمان شمارش دستی کلونی‌ها می افزاید. برای بهبود دقت و کارایی، ظرف پتری را در دستگاه شمارش کلنی خودکار قرار دهید. شمارنده‌های کلونی خودکار تصویری از پلیت می‌گیرند، کلنی‌ها را از پس‌زمینه جدا می‌کنند و سپس از یک الگوریتم برای شمارش کلنی‌های روی پلیت استفاده می‌کنند. هنگامی که دو یا چند کلنی در لبه‌ها با هم تماس دارند، الگوریتم‌ها می‌توانند در تمایز کلونی‌ها با مشکل مواجه شوند، بنابراین این حوزه نرم‌افزاری باید گسترش پیدا کند.
پیچیده شدن شمارش
دقت محاسبه تراکم میکروب از تعداد کلنی‌ها دارای محدودیت‌هایی است. واحدهای تشکیل دهنده کلنی می‌توانند یک سلول منفرد، یک زنجیره از سلول‌ها یا یک دسته کامل از سلول‌ها باشند. فرض این است که یک کلنی یک سلول را نشان می‌دهد، بنابراین غلظت محاسبه شده از تعداد کلنی‌ها می‌تواند کم باشد. میکروب‌های مختلف به شرایط رشد متفاوتی نیاز دارند، و کلنی‌های روی پلیت فقط نشان دهنده میکروب‌هایی هستند که در آن محیط رشد تحت آن شرایط انکوبه رشد می‌کنند. علاوه بر این، شمارش کلونی سلول‌های مرده را ثبت نمی‌کند، که در مواردی که به غلظت سلول‌ها در نمونه اصلی نیاز دارید، مهم است.
چگونه مقدار باکتری موجود را محاسبه کنیم؟
دانشمندان از رقت‌های سریالی (یک سری رقت های 1:10) برای محاسبه تراکم جمعیت کشت‌های باکتریایی استفاده می‌کنند. وقتی قطره‌ای از کشت حاوی تعداد کمی باکتری کاشته می‌شود و انکوبه می‌شود، هر سلول از نظر تئوری به اندازه کافی از سلول‌های دیگر دور می‌شود و کلنی خود را تشکیل می‌دهد. (در واقع، برخی از کلنی ها ممکن است از نسل دو سلول مجاور باشند، اما این امر در کشت های رقیق شده نادر است، و بنابراین تعداد کلنی ها تخمین بسیار خوبی از تعداد سلول‌هایی است که در ابتدا به پلیت منتقل شده‌اند.) چون تراکم جمعیت ناشناخته است، باید از انواع رقت‌ها استفاده کرد تا در نهایت یک پلیت با تعداد مناسبی از کلنی‌ها به دست آید.
رقت های سریالی (Serial Dilutions)
شش لوله آزمایش (که هر کدام حاوی 9 میلی لیتر محیط رشد هستند) را به صورت 1 تا 6 برچسب گذاری کنید. شش پلیت آگار را از 1 تا 6 علامت بزنید. از یک پیپت و تیپ پیپت استریل 1 میلی لیتری برای انتقال 1 میلی لیتر از کشت باکتری به داخل لوله 1 استفاده کنید.
خوب مخلوط کنید و 1 میلی لیتر از لوله 1 را با استفاده از پیپت و تیپ های 1 میلی لیتری استریل به لوله 2 منتقل کنید.
مرحله 2 را برای لوله‌های باقی مانده تکرار کنید، هر بار 1 میلی لیتر از لوله قبلی به لوله بعدی منتقل کنید.
برای انتقال 0.1 میلی لیتر از لوله 1 به پلیت آگار از یک پیپت و تیپ 0.1 میلی لیتری استریل استفاده کنید. یک میله شیشه ای L شکل را با شعله حرارت داده تا سرخ شود و با استفاده از آن قطره را به طور یکنواخت در اطراف پلیت پخش کنید. پلیت را به مدت 48 ساعت در دمای مناسب برای باکتری مورد استفاده انکوبه کنید. انواع مختلف باکتری دمای رشد مطلوب متفاوتی دارند. اگر نمی توانید دمای بهینه رشد مرجع را پیدا کنید، سعی کنید پلیت را در دمای 25 و 37 درجه انکوبه کنید.
مرحله 4 را تکرار کنید، هر بار مایع را از یک لوله آزمایش مختلف به پلیت مربوطه آن منتقل کنید.
محاسبه جمعیت ها (Population Calculations)
شش پلیت را مشاهده کنید و پلیتی را با 30 تا 200 کلنی مجزا انتخاب کنید.
تعداد کلنی‌های روی پلیت را در 10 ضرب کنید تا تعداد سلول‌ها در هر میلی لیتر کشت از لوله رقت مورد استفاده محاسبه شود.
عدد مرحله 2 را در 10^(شماره پلیت) ضرب کنید تا تعداد سلول‌ها در هر میلی لیتر کشت اصلی محاسبه شود. مقدار 10^(شماره پلیت) ضریب رقیق سازی کشت مورد استفاده برای کشت آن پلیت است.
چگونه رشد باکتری در ظروف پتری را اندازه گیری کنیم؟
باکتری‌ها در ظروف پتری روی یک محیط جامد به نام آگار باکتریایی رشد می‌کنند که در آن کلونی‌های دایره‌ای شکل می‌گیرند. برخلاف سلول‌های باکتریایی منفرد، کلنی گروهی از باکتری‌ها به اندازه‌ی کافی بزرگ هستند که با چشم غیر مسلح قابل مشاهده باشند. رشد باکتری را می‌توان با مشاهده ساده تعداد کلنی‌های موجود اندازه گیری کرد.
با این حال، روش‌های کمی بیشتر شامل استفاده از محفظه شمارش (counting chamber)، یا اغلب، شمارش پلیت‌های دارای زنده مانی است. مورد دوم بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرد زیرا اطلاعات کیفی مانند تأثیر شرایط رشد متفاوت را نیز ارائه می‌دهد. از آنجایی که ممکن است میلیاردها باکتری در یک ظرف پتری وجود داشته باشد، اندازه گیری ابتدا نیاز به رقیق کردن نمونه دارد تا بتوان تعداد کلنی ها را شمارش کرد.
در یک لوله آزمایش، 10 میکرولیتر از کشت اولیه باکتری را به 90 میکرولیتر محیط رقیق کننده اضافه کنید. درب لوله را محکم ببندید و به آرامی ورتکس کنید تا مخلوطی همگن به دست آید. اکنون نمونه یک دهم غلظت اولیه است.
10 میکرولیتر از این نمونه جدید را به یک لوله آزمایش جدید حاوی 90 میکرولیتر محیط رقیق‌کننده منتقل کرده، دوباره مخلوط کنید. یک بار دیگر، نتیجه این خواهد بود که نمونه بیشتر رقیق شود – اکنون یک صدم غلظت اولیه آن خواهد بود. این کار را چندین بار تکرار کنید، تا زمانی که نمونه اصلی بین 104 تا 1010 بار رقیق شود. اطمینان حاصل کنید که هر لوله با رقت صحیح برچسب گذاری شده است، به عنوان مثال 10-1، 10-2 و غیره.
10 میکرولیتر از آخرین رقت کامل شده را روی پلیت آگار بریزید. با استفاده ازیک لبه پخش کننده، محلول باکتریایی را در سراسر سطح پلیت آگار پخش کنید. این کار را برای دو پلیت دیگر تکرار کنید. همچنین انجام این مراحل با سطوح دیگر رقت برای مقایسه معمول است. حتماً کف پلیت‌ها را برچسب بزنید. درب‌های هر پلیت را عوض کنید و بگذارید پلیت‌های آگار برای چند دقیقه روی بنچ آزمایشگاهی کنار شعله یا در انکوباتور خشک شوند. پلیت ها را در انکوباتور قرار دهید که باید در دمای مناسب برای سویه باکتری تنظیم شود. بگذارید 12 تا 16 ساعت رشد کند.
کلونی‌ها باید پس از 16 ساعت قابل مشاهده باشند. وقتی کلونی‌ها قابل مشاهده شدند، پلیت را بیرون بیاورید و آن‌هایی را پیدا کنید که بین 30 تا 300 کلنی دارند. با استفاده از یک مارکر، کف پتری دیش را (سمتی که آگار دارد، نه درب آن)هر جا که کلنی از طریق آگار قابل مشاهده است، نقطه گذاری کنید. هر نقطه را بشمارید. برای هر پلیت تکرار کنید.
برای اندازه گیری مقدار باکتری در کشت اولیه برای این آزمایش، رقت باید در محاسبات در دو مکان معکوس شود. اولاً، وقتی یک میکرولیتر از لوله آزمایش برداشتید تا در پتری دیش قرار دهید، یک دهم نمونه رقیق شده را برداشتید، بنابراین باید همه چیز را در 10 ضرب کنید تا آن را برعکس کنید. علاوه بر این، اگر ضریب رقت در لوله آزمایش، به عنوان مثال، 7-10 بود، برای معکوس کردن اثر رقت، تعداد کلنی‌ها باید در 107 ضرب شود. به سادگی علامت منفی را از توان در محاسبات حذف کنید. از فرمول استفاده کنید:
[تعداد کلنی های شمارش شده] × 10 × [چند بار نمونه باید ضرب شود تا به غلظت اصلی برسد: به عنوان مثال، 105] = تعداد واحدهای تشکیل کلنی (CFU) در هر میلی لیتر از شروع کشت.این میزان رشد باکتری در ظروف پتری شما است.
CFU چیست؟
زمانی که دانشمندان می‌خواهند بدانند چند میکروارگانیسم در محلول باکتری یا قارچ وجود دارد، معمولاً شمارش هر سلول به صورت جداگانه در زیر میکروسکوپ بسیار زمان بر است. با رقیق کردن نمونه‌ای از میکروب‌ها و پخش آن در صفحه پتری، میکروبیولوژیست‌ها می‌توانند در عوض گروه‌هایی از میکروب‌ها را که کلونی نامیده می‌شوند، با چشم غیر مسلح بشمارند. فرض بر این است که هر کلنی از یک واحد تشکیل دهنده کلنی(colony-forming unit) یا CFU رشد کرده است.
سپس دانشمندان می‌توانند از شمارش CFU برای تعیین تقریبی تعداد میکروب‌ها در نمونه اصلی استفاده کنند. به عنوان مثال، اگر 200 کلونی در یک پلیت ایجاد شده با یک نمونه 1 میلی لیتری از محلول رقیق شده 1000 برابر استوک اولیه آن شمارش شود، محلول اصلی تقریباً حاوی 200000 CFU در هر میلی لیتر است. هر CFU لزوماً با یک میکروب منفرد مطابقت ندارد. اگر سلول‌ها به صورت توده یا زنجیره به هم بچسبند، CFU در عوض به این گروه بندی‌ها اشاره می‌کند.
