ساترن بلاتینگ چیست؟

مقدمه‌ای بر ساترن بلاتینگ

بلاتینگ در زیست شناسی مولکولی برای شناسایی پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک و به طور گسترده ای برای اهداف تشخیصی استفاده می شود. این تکنیک مولکول مورد نظر را روی یک تکیه گاه که غشای نیتروسلولزیک یا نایلون است، بی حرکت می کند. این روش از تکنیک های هیبریداسیون برای شناسایی اسیدهای نوکلئیک و ژن های خاص استفاده می کند.

تکنیک بلاتینگ ابزاری است که برای شناسایی مولکول های زیستی مانند DNA، mRNA و پروتئین در مراحل مختلف بیان ژن استفاده می شود. سنتز پروتئین شامل بیان بخشی از DNA است که برای تولید پروتئین مربوطه به mRNA تبدیل می شود. مولکول هایی مانندDNA ، RNA و پروتئین ها تحت تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی قرار می گیرند که با استفاده از تکنیک های بلاتینگ جدا می شوند.

در سلول، این مولکول ها به طور مخلوط و در هم آمیخته وجود دارند و از این رو با کمک بلاتینگ دانشمندان می توانند یک مولکول خاص را از بین همه مولکول های دیگر تشخیص دهند.

بلاتینگ با عبور دادن مخلوطی از مولکول های مورد علاقه از یک بلوک ژلی انجام می شود که مولکول ها را بر اساس اندازه مولکولی آن ها جدا می کند. از این رو مولکول های پردازش شده باید به سختی در غشایی مناسب فشرده شوند که به نوبه خود مولکول ها را از ژل به غشای مناسب (نایلون، نیتروسلولز یا PVDF) از طریق عمل مویرگی منتقل می کند. پس از انتقال مولکول ها به غشا، موقعیت آن ها تغییر نمی کند.

ساترن بلاتینگ (Southern blotting) توسط Edward Southern در سال 1975 به عنوان روشی برای تشخیص توالی های خاص DNA در نمونه های DNA معرفی شد. سایر تکنیک های بلاتینگ حاصل از این روش عبارتند از: نورترن (Northern) بلات (برای RNA)، وسترن (Western) بلات (برای پروتئین‌ها) ، ایسترن (Eastern) بلات (برای اصلاح پروتئین پس از ترجمه) و سات-وسترن (South-western) بلات (برای برهم کنش های DNA و پروتئین).

زیرگونه های تکنیک بلاتینگ به مولکول مورد نظری که به دنبال آن هستیم، بستگی دارد. هنگامی که یک توالی DNA، پایه یا رمز مولکول پروتئین است، می توان مولکول DNA مورد نظر را با استفاده از تکنیک Southern Blotting مشخص کرد. در طول بیان ژن، هنگامی که DNA به عنوان mRNA برای تولید پروتئین بیان می شود، می توان این فرآیند را با نورترن بلات مشخص کرد. در نهایت، mRNA کد شده پروتئین مربوطه را تولید می کند و این پروتئین را می توان با وسترن بلات شناسایی کرد.

روش های بلاتینگ به عنوان یک دستیار در الکتروفورز ژل در نظر گرفته شده که عموماً برای جداسازی DNA، RNA و پروتئین استفاده می شوند و نتایج قابل تکراری را که به قدرت حل کنندگی عالی آن ها نسبت داده می شود، ارائه می دهند. بدین ترتیب، مولکول های خاصی را می توان در میان ترکیب مولکول هایی که در معرض جداسازی هستند، تشخیص داد.

اکثر روش ها دارای یک مرحله کلی هستند که در آن مولکول های مورد نظر پس از جداسازی از ژل به مرحله غشای جامد منتقل می شوند که این مرحله با خیساندن در محلول روی ژل و غشا از طریق کاغذی نفوذ پذیر انجام می شود. انواع مختلفی از دستگاه های چند وجهی نیز از طرف بسیاری از تامین کنندگان برای الکتروبلاتینگ ارائه می شود که در مقایسه با ژل های متخلخل متداول آگارز، به طور خاص برای انتقال از ژل های پلی آکریل آمید متخلخل مفیدتر هستند.

در رابطه با DNA و RNA، تشخیص توالی های خاص در غشا از طریق هیبریداسیون با پروب های دارای برچسب اسید نوکلئیک انجام شده و در مورد پروتئین ها با استفاده از پروب های آنتی بادی برچسب دار جایگزین می شود. پروتکل های اولیه توسعه یافته پروب های رادیواکتیو دارای برچسب ایزوتوپ های رادیواکتیو را برای اهداف تشخیص از طریق اجرای روش های اتورادیوگرافی مورد استفاده قرار دادند.

در این فرایند از الگوی انتشار رادیویی که از یک ماده رادیواکتیو ساطع می شود، برای تولید تصویری بر روی یک فیلم اشعه ایکس استفاده می شود که همچنین می تواند با استفاده از آشکارسازهای گازی جرقه ای یا سیستم های مبتنی بر تصویربرداری از فسفر، به عنوان یک تصویر دیجیتالی در دسترس قرار گیرد.

با در نظر گرفتن اثرات مضر قرار گرفتن در معرض رادیواکتیویته، انواع دیگر سیستم های برچسب زنی (labeling) توسعه یافته اند که شامل معرف های فلورسنت (fluorescent) و کمیلومینسنت (chemiluminescent) است. روش های مبتنی بر لومینانس و فلورسانس، حساس و بدون پس زمینه در نظر گرفته می شوند و بنابراین نتایج دقیق تری ارائه می شود.

همچنین، چندین تغییر دیگر نیز وجود دارد که برخلاف روش اصلی انجام شده اند، مانند این که پروب های DNA بیشتر از RNA استفاده می شوند، غشا های نایلونی جایگزین نیتروسلولز سنتی شده اند تا از رناتوراسیون (باز شدن مارپیچ دو رشته ای) DNA در هنگام انتقال جلوگیری شود. این انتقال در آلکالین انجام می شود که به صورت قلیایی و طبق پروتکل اصلی در محلول خنثی نگهداری شده است.

برای کاهش اندازه DNA به منظور افزایش سرعت انتقال قطعات بزرگتر، آن را در معرض اسید قرار می دهند. نوار ها و تیوب های ژل که در پروتکل اصلی اعمال شده اند دیگر مورد استفاده قرار نمی گیرند و در عوض از قالب های ژل استفاده می شود. اگرچه تغییرات زیادی در پروتکل اصلی ایجاد شده است اما پروتکل های امروزی اکثر ویژگی های اساسی پروتکل اصلی را حفظ کرده اند.

در بسیاری از مطالعات مهم مانند نقشه برداری ژنتیکی ژنوم انسان که بر اساس بلاتینگ مبتنی بر تشخیص قطعات طولی چندشکلی محدودکننده انجام شد، ساترن بلات استفاده گردید. همچنین، اثر DNA برای اولین بار از طریق هیبریداسیون محصولات هضم محدود کننده DNA انسان با کاوشگرهای کوچک پروبی ایجاد شد.

با این حال، بسیاری از کاربرد های اولیه این روش در حال حاضر با تعیین توالی DNA و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) جایگزین شده اند زیرا حقایق یا داده های گسترده تری را ارائه می دهند و علاوه بر این به راحتی قابل پیاده سازی هستند.

با این وجود، بلاتینگ هنوز در بسیاری از عرصه ها مانند اندازه گیری تعداد کپی، تجزیه و تحلیل توالی های طولانی DNA که توالی یابی و تقویت آن ها با استفاده از PCR یا توالی یابی DNA مشکل است، استفاده می شود. همچنین این روش در تجزیه و تحلیل های ساختاری DNA که در آن شکل فیزیکی DNA با استفاده از الکتروفورز ژل دو بعدی جدا شده و سپس با استفاده از بلاتینگ اجزای خاص تشخیص داده می شود نیز کاربرد دارد.

پیشینه تاریخی

توانایی هیبرید شدن رشته های DNA از ماهیت مکمل آن ناشی می شود که به وضوح در مدل ساختار DNA واتسون-کریک نشان داده شده است. در ابتدا آزمایش هایی برای بررسی توانایی تغییر شکل DNA و تشکیل هیبریدهای DNA-RNA برای درک بیان خاص پروتئین در بافت یا سلول انجام شد.

پس از آن، هیبریداسیون با توسعه پروب هایی که می توانند توالی های خاصی را در داخل هدف و بی حرکتی توالی های هدف را بر روی یک تکیه گاه جامد مانند پودر نیتروسلولز که بیشتر غشاهای نیتروسلولز را ایجاد می کند، تشخیص دهند، انجام گرفت. ساترن بلات نشان می دهد که قطعات DNA جدا شده توسط الکتروفورز ژل می توانند بر اساس یک الگوی هیبریداسیون و اندازه مولکولی خود به یک غشاء منتقل شوند. بعدها این روش برای شناسایی فضایی اهداف و بلاتینگ کلنی های باکتریایی استفاده شد.

مرحله الکتروفورز را می توان با استفاده از دو نوع مختلف ژل مانند ژل پلی اکریل آمید (PAGE) با اوره یا سدیم دودسیل سولفات (SDS) با اوره انجام داد. این دو ژل کاربرد متفاوتی دارند. هنگام استفاده از ژل PAGE، همان مقدار قطعات DNA به کاغذ بلاتینگ منتقل می شود. در صورت استفاده از SDS، وضوح پهنای باند تشکیل شده ثابت می ماند.

در این تکنیک مولکول DNA به اندازه 100 pg قابل شناسایی است. این تکنیک را می توان در تشکیل DNA دو رشته ای که دارای یک رشته از DNA هدف و دیگری از پروب DNA است، خلاصه کرد. پروب DNA به طور اختصاصی برای توالی مورد نظر در شرایط آزمایشگاهی تولید می شود.

ساترن بلات (Southern blot)

ساترن بلات یک روش آزمایشگاهی است که برای تشخیص مولکول های خاصی از DNA از بین بسیاری از مولکول های DNA دیگر استفاده می شود. این تکنیک از نام مخترع آن، Edward Southern، گرفته شده است. به عنوان یک روش آزمایشگاهی، از ساترن بلات می توان برای تجزیه و تحلیل کل DNA یک موجود زنده – که به عنوان ژنوم آن نیز شناخته می شود – استفاده کرد تا توالی خاص مورد نظر را شناسایی کند.

اولین قدم در ساترن بلات این است که مخلوط DNA را با استفاده از پروتئینی به نام آنزیم محدود کننده (restriction enzyme) به قطعات کوچک تقسیم کنید. سپس مخلوط قطعات DNA با توجه به اندازه با استفاده از تکنیکی به نام الکتروفورز ژل جدا می شود. پس از جداسازی، قطعات دو رشته ای DNA در ژل تغییر شکل داده یا جدا (دناتوره) می شوند. سپس، DNA از ژل به غشای بلاتینگ منتقل می شود. اگرچه این مرحله همان چیزی است که به این تکنیک نام «ساترن بلات» می دهد اما این اصطلاح معمولاً برای توصیف کل روش استفاده می شود.

پس از اتمام انتقال، غشا همه نوارهای اصلی را روی ژل حمل می کند. سپس غشاء در معرض قطعه کوچکی از DNA یا RNA به نام پروب قرار می گیرد که دارای توالی ای است که مکمل توالی DNA خاصی در نمونه است. این کار اجازه می دهد تا پروب با یک قطعه DNA خاص در غشاء هیبرید شده یا به آن متصل شود. علاوه بر این، پروب دارای نشانه است که معمولاً یک اتم رادیواکتیو یا یک رنگ فلورسنت می باشد. بنابراین، پس از هیبریداسیون، پروب اجازه می دهد تا قطعه DNA مورد نظر از بین بسیاری از قطعات مختلف DNA بر روی غشا تشخیص داده شود.

 کاربرد های ساترن بلات

در بسیاری از زمینه از ساترن بلات استفاده می شود. اولین استفاده از ساترن بلات این است که یک DNA خاص را در یک نمونه DNA شناسایی کنیم. این روش بیشتر در شناسایی عفونت های ویروسی و برخی عفونت های باکتریایی استفاده می شود. در فناوری rDNA، از تکنیک ساترن بلات برای جداسازی یک DNA خاص استفاده می شود.

همچنین این تکنیک در مطالعه جهش و بازآرایی ژن مفید بوده و از آن برای تشخیص بیماری های نوزادی و بیماری های ژنتیکی استفاده می شود. به دلیل دقت در شناسایی DNA، این تکنیک در مطالعات فیلوژنتیک (phylogenetic)، تجزیه و تحلیل paternity & maternity، مطالعات پزشکی قانونی و شناسایی شخصی استفاده می شود.

ساترن بلات می تواند در مطالعه ساختار یک ژن یا برای روشن شدن نقشه های آنزیم محدود کننده استفاده شود. به طور خاص، از ساترن بلات می توان در شناسایی محل های متیله شده موجود در مورد برخی ژن ها به طور خاص استفاده کرد.

استفاده از نوکلئاز های محدود کننده مانند Mspe کشف کننده RFLP ها با استفاده از ساترن بلات، در نقشه برداری چندین ژنوم که برای نقشه برداری بسیار مهم بودند، کمک کننده بود. در زمینه ایمونولوژی، بازآرایی کلونال ایمونوگلوبولین ها و همچنین ژن های گیرنده سلول T که نقش مهمی در ایجاد پاسخ ایمنی دارند، می تواند با استفاده از ساترن بلات آنالیز شود.

مترجم: فاطمه فریادرس

مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی

مطالعه در pubmed