تست اوره آز

اوره آگار توسط کریستنسن در سال 1946 برای تمایز باسیل‌های روده‌ای ساخته شد. تست اوره آز برای تعیین توانایی ارگانیسم در تقسیم اوره از طریق تولید آنزیم اوره آز استفاده می‌شود.

اصل تست اوره آز

اوره محصول دکربوکسیلاسیون اسیدهای آمینه است. هیدرولیز اوره باعث تولید آمونیاک و CO₂  می‌شود. تشکیل آمونیاک باعث قلیایی شدن محیط می‌شود و تغییر pH با تغییر رنگ فنل قرمز از نارنجی روشن در pH 6.8 به سرخابی (صورتی) در pH 8.1 تشخیص داده می‌شود. ارگانیسم‌های اوره آز مثبت سریع کل محیط را در عرض 24 ساعت صورتی می‌کنند.

ارگانیسم‌های ضعیف ممکن است چند روز طول بکشد و موجودات منفی در نتیجه تولید اسید هیچ تغییر رنگی یا زردی ایجاد نمی‌کنند.

تست سریع اوره آز (RUT)

تست اوره آز سریع (RUT) یک تست تشخیصی رایج برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری است. این یک آزمایش سریع، ارزان و ساده است که وجود اوره آز را در مخاط معده یا روی آن تشخیص می‌دهد. همچنین به عنوان آزمایش CLO (تست ارگانیسم شبه کامپیلوباکتر) شناخته می‌شود. این آزمایش از روشی به نام آندوسکوپی معده و بیوپسی برای جمع آوری سلول‌های پوشش معده استفاده می‌کند.

این آزمایش در زمان گاستروسکوپی انجام می‌شود. بیوپسی از مخاط از آنتروم معده گرفته می‌شود و در محیطی حاوی اوره و شاخصی مانند فنل قرمز قرار می‌گیرد. اوره آز تولید شده توسط هلیکوباکتر پیلوری، اوره را به آمونیاک هیدرولیز می‌کند که PH محیط را افزایش می‌دهد و رنگ نمونه را از زرد (منفی) به قرمز (مثبت) تغییر می‌دهد.

این آزمایش همچنین می‌تواند برای ارائه یک ارزیابی غیررسمی از دقت نتایج هیستوپاتولوژی استفاده شود و اختلافات باید باعث بازبینی هیستوپاتولوژی و گفتگو با پاتولوژیست شود.

تست تنفس اوره

تست تنفس اوره یک آزمایش غیرتهاجمی رایج برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری بر اساس فعالیت اوره آز است. این تست بسیار حساس و خاص است.

بیمار مبتلا به اوره با برچسب رادیواکتیو (کربن-14 رادیواکتیو یا کربن-13 غیر رادیواکتیو) را می‌خورد. اگر عفونت وجود داشته باشد، اوره آز تولید شده توسط هلیکوباکتر پیلوری، اوره را هیدرولیز می‌کند تا آمونیاک و بی‌کربنات برچسب گذاری شده را که به عنوان CO2 بازدم می‌شود، تشکیل دهد. CO2 نشاندار شده یا توسط یک شمارنده سوسوزن (کربن-14) و یک طیف سنجی جرمی نسبت ایزوتوپی یا توسط طیف سنجی همبستگی جرمی (کربن-13) شناسایی می‌شود.

موارد استفاده از تست اوره آز

1. این آزمایش برای تمایز ارگانیسم‌ها بر اساس توانایی آنها در هیدرولیز اوره با آنزیم اوره آز استفاده می‌شود.
2. این آزمایش می‌تواند به عنوان بخشی از شناسایی چندین جنس و گونه انتروباکتریاسه، از جمله پروتئوس، کلبسیلا، و برخی گونه های یرسینیا و سیتروباکتر و همچنین برخی از گونه‌های کورینه باکتریوم استفاده شود.
3. همچنین شناسایی Cryptococcus spp، Brucella، Helicobacter pylori و بسیاری دیگر از باکتری‌هایی که آنزیم اوره آز را تولید می‌کنند، مفید است.
4. این آزمایش به طور مستقیم بر روی نمونه‌های بیوپسی معده برای تشخیص وجود هلیکوباکتر پیلوری انجام می‌شود.

محیط مورد استفاده در تست اوره آز

اوره آگار کریستنسن

مواد لازم در هر لیتر آب دیونیزه:

ترکیب بندی:

• اوره 20.0 گرم
• کلرید سدیم 5.0 گرم
• مونوپتاسیم فسفات 2.0 گرم
• پپتون 1.0 گرم
• دکستروز 1.0 گرم
• فنل قرمز 0.012 گرم
• آگار 15.0 گرم
• pH نهایی 6.7 +/- 0.2 در 25 درجه سانتیگراد.

آماده سازی

1. مواد را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کنید و فیلتر استریل کنید (اندازه منافذ 0.45 میلی متر).
2. آگار را در 900 میلی لیتر آب مقطر معلق کرده، بجوشانید تا کاملا حل شود.
3. اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و 15 psi به مدت 15 دقیقه.
4. آگار را در دمای 50 تا 55 درجه سانتیگراد خنک کنید.
5. 100 میلی لیتر از پایه اوره استریل شده با فیلتر را به صورت غیر عفونی به محلول سرد آگار اضافه کنید و کاملاً مخلوط کنید.
6. 5 تا 6 میلی‌لیتر در هر لوله استریل (100×13 میلی‌متر) توزیع کنید و لوله‌ها را در حین سرد شدن کج کنید تا جامد شوند.

روش آزمایش اوره آز

1. سطح یک مایل اوره آگار را با قسمتی از یک کلنی به خوبی ایزوله شده بپوشانید یا سطح شیبدار را با 1 تا 2 قطره از کشت یک شبه براث انفوزیون مغز-قلب تلقیح کنید.
2. درپوش را شل بگذارید و لوله را در دمای 35-37 درجه سانتیگراد در هوای محیط به مدت 48 ساعت تا 7 روز انکوبه کنید.
3. برای ایجاد رنگ صورتی تا 7 روز بررسی کنید.

تفسیر نتایج تست اوره آز

واکنش مثبت: ایجاد رنگ سرخابی تیره تا صورتی روشن در 15 دقیقه تا 24 ساعت.

به عنوان مثال  Proteus spp، Cryptococcus spp، Corynebacterium spp، هلیکوباکتر پیلوری، Yersinia spp، Brucella spp  و غیره.

واکنش منفی: بدون تغییر رنگ.

به عنوان مثال: اشریشیا، شیگلا، سالمونلا و غیره.

کنترل کیفیت تست اوره آز

مثبت: پروتئوس ولگاریس (ATCC13315)

مثبت ضعیف: کلبسیلا پنومونیه (ATCC13883)

منفی: اشریشیا کلی (ATCC25922)

محدودیت‌های تست اوره آز

1. برخی از موجودات زنده به سرعت اوره آزاد می‌کنند (بروسلا و هلیکوباکتر پیلوری)، در حالی که برخی دیگر به آرامی واکنش نشان می‌دهند.
2. توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایشات بیوشیمیایی و یا سرولوژیک روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
3. برای تسهیل رشد و واکنش هیدرولیز اوره، از تلقیح از سوسپانسیون براث استفاده نکنید.
4. پس از مدت زمان انکوباسیون ممکن است یک واکنش قلیایی مثبت کاذب مشاهده شود. برای رد این اتفاق، آزمایش را با یک کنترل (لوله اوره آگار تلقیح نشده) همراه با لوله تلقیح شده در طول مدت انکوباسیون بررسی کنید.
5. اوره آگار کج را حرارت ندهید، زیرا اوره هنگام گرم شدن خیلی راحت تجزیه می‌شود.
6. برای شناسایی گونه‌های پروتئوس، آگار اوره، اسلنت‌ها باید در مدت 6 ساعت پس از تلقیح از نظر واکنش بررسی شوند.
7. اوره آگار نباید برای تعیین میزان کمی فعالیت اوره آز استفاده شود، زیرا موجودات زنده از نظر توانایی و سرعت هیدرولیز متفاوت هستند.
8. انکوبه نکردن این محیط با درپوش‌های شل ممکن است باعث ایجاد نتایج اشتباه شود.
9. اوره به نور حساس است و می‌تواند تحت اتوهیدرولیز قرار گیرد. در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شود.

دوره مهارت آموزی میکروبیولوژی

منبع

مترجم: امید آهنگریان ابهری