آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول: از کجا می‌آید و چگونه از آن جلوگیری کنیم؟

اگر در حال خواندن این مقاله هستید، احتمالاً به آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی خود مشکوک هستید یا می‌خواهید یک پروژه کشت سلولی جدید را آغاز کنید. اگر مایکوپلاسما در آزمایشگاه شما وجود دارد، تعجب نکنید. آنها در اکثر تجهیزات کشت سلولی وجود دارند. آزمایشگاه‌های کشت بافت و هر کشت دهنده سلول باید با این مشکل مقابله کند. تخمین زده میشود که مایکوپلاسما مسئول 60 درصد آلودگی در کشت سلولی است. مایکوپلاسماها یکی از ساده‌ترین و کوچکترین باکتری‌ها هستند.

عدم وجود دیواره سلولی سفت و سخت باعث می‌شود که آنها در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها و داروهای ضد باکتریایی مانند پنی سیلین و استرپتومایسین مقاوم شوند. مایکوپلاسما به دلیل توانایی آن در تغییر شکل و عدم وجود دیواره سلولی سفت و سخت می‌تواند از روش‌های فیلتراسیون عبور کند. در این جا، برخی از بهترین راه‌ها را برای مقابله با آلودگی مایکوپلاسما قبل از این که به کشت سلولی وارد شوند و آن‌چه که در صورت مواجهه با آلودگی مایکوپلاسما باید انجام دهید را توضیح خواهیم داد.

علل آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول

ورود مایکوپلاسماها به کشت سلولی منشاءهای مختلفی دارد که ردیابی آنها دشوار است. این منشاءها می‌توانند پرسنل آزمایشگاه، سرم، محیط کشت سلولی، حمام‌های آب (Water bath)، انکوباتورها (Incubator) و غیره باشند. آلودگی توسط انسان بزرگترین منشاء آلودگی در میان موارد ذکر شده در بالا است.

این آلاینده‌ها می‌توانند از طریق لباس‌های کثیف، لباس‌های آزمایشگاهی، صحبت کردن در جایی که جریان هوای لامینار (Laminar airflow) وجود دارد، پوست سر انسان، عطسه، سرفه و غیره پخش شوند. همچنین ورود مداوم افراد در جایی که کشت‌های سلولی نگهداری می‌شوند، خطر آلودگی را افزایش می‌دهد. مایکوپلاسما می‌تواند از طریق آلودگی متقاطع (Cross-contamination) و به دلیل روش‌های کاری نادرست آزمایشگاهی (شامل استفاده مجدد از پیپت برای چندین رده سلولی به جای استفاده از انواع یکبار مصرف آن یا استفاده مجدد از دستکش)، از این منابع پخش شود. سرم‌ها هم منبع آلودگی به مایکوپلاسما است.

به دلیل ماهیت کدر آن، تشخیص آلودگی در سرمی که معمولاً برای هر کشت سلولی استفاده میشود، دشوار است. استفاده مجدد از یک بطری سرم برای هر زیرکشت میتواند رشد مایکوپلاسما را افزایش دهد. این سرم غنی از مواد مغذی و بهترین منبع برای تکثیر مایکوپلاسما است. بعلاوه سرم پس از اتوکلاو (Autoclave) به محیط اضافه میشود، از این رو، هیچ اطمینانی در مورد آلوده نبودن سرم وجود ندارد. آئروسل‌هایی (Aerosol) که در حین کار در جریان هوای لامینار تولید میشوند (هنگام صحبت یا پیپت کردن) نیز از جمله دلایل اصلی آلودگی هستند.

اگر رده سلولی برای مدت طولانی‌تری در معرض هوا بماند، این آئروسل‌های تولید شده یا در طی فرآیندهای زیرکشت یا از هوا وارد محیط کشت میشوند. آئروسل‌ها با چشم غیرمسلح قابل دیدن نیستند، بنابراین تا زمانی که منجر به آلودگی نشوند، قابل شناسایی نیستند.

یک منبع دیگر آلودگی، محیط‌های مورد استفاده برای زیرکشت است که به دو صورت مایع و پودری موجود است. به دلیل استفاده نادرست یا روش‌های کاری نادرست آزمایشگاهی، مایکوپلاسما میتواند در این محیط‌های پودری پخش شود. فیلتراسیون گندزدایی کامل را تضمین نمی‌کند زیرا مایکوپلاسما حتی می‌تواند از فیلترهای 0.2 میکرونی عبور کند.

شکل 1: آلودگی! محیط‌های کشت بافت اغلب نشانگرهایی در محیط دارند که با کاهش pH به دلیل آلودگی میکروبی زرد می‌شوند.

مایکوپلاسماها می‌توانند برای مدت طولانی‌تری در محیط خشک باقی بمانند. هنگامی که در تماس با یک منبع مغذی قرار میگیرند، در مدت کوتاهی شروع به تکثیر می‌کنند. هنگامی که آنها در محیط آزمایشگاه وجود دارند، از بین بردن آنها به طور کامل دشوار است. شما می‌توانید مانع رشد مایکوپلاسماها شوید اما نمی‌توانید آن را به طور کامل از بین ببرید. هنگامی که مایکوپلاسما در کشت مشاهده شد، دور انداختن فلاسک‌ها (Flask) گزینه خوبی است (مگر اینکه منبع کشت غیر قابل تعویض یا بسیار گران باشد).

تشخیص آلودگی مایکوپلاسما

یافتن مایکوپلاسما با چشم غیرمسلح یا به وسیله میکروسکوپ نوری می‌تواند بسیار دشوار باشد، بنابراین چگونه از کجا بدانیم آلودگی وجود دارد؟ برای این کار، می‌توانید از تشخیص مبتنی بر PCR (Polymerase Chain Reaction)، رنگ‌آمیزی DNA، برچسب‌گذاری فلورسنت، ظرف آگار (Agar plate) و غیره استفاده کنید. در ادامه تکنیک‌هایی ذکر شده و شما باید هر کدام که مناسب­تر است را برای تشخیص آلودگی انتخاب کنید و همیشه برای اطمینان 100% از یک آزمایش دوم هم استفاده کنید.

قبل از آزمایش مایکوپلاسما، سلول­‌ها باید حداقل به مدت دو هفته در کشت پیوسته (Continuous culture) باشند تا زمان کافی برای رشد سطوح پایین آلودگی‌­ها فراهم شود. برای آزمایش، حداقل دو یا سه روز قبل از نمونه برداری نباید محیط را تغییر داد.

• کشت بر روی ظروف آگار یا محیط کشت براث (Broth) به عنوان “استاندارد طلایی” برای تشخیص مایکوپلاسما در نظر گرفته می­شود. در این روش، مایع رویی حاصل از کشت سلولی به محیط مایع یا نیمه جامد (حاوی مواد مغذی ضروری برای رشد مایکوپلاسما) اضافه می­شود. کشت سلولی که آلوده باشد، هم در براث و هم در ظروف آگار رشد مایکوپلاسما را نشان می­دهد و کلنی‌­های مایکوپلاسما به راحتی در ظروف آگار قابل مشاهده هستند. این روش قادر است بیشتر گونه­‌های مایکوپلاسما را به غیر از تعداد کمی از آن­ها شناسایی کند.
• روش دیگری که برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما استفاده می­شود استفاده از PCR است. در این روش از پرایمرهای PCR مخصوص ژن­‌های RNA ريبوزومي 16 سوودبرگ (16S rRNA gene) مربوط به مایکوپلاسماهای مختلف استفاده می‌شود. طیف وسیعی از این پرایمرها تقریباً تمام مایکوپلاسمای عفونی کننده را شناسایی می­کنند. پرایمرهای مورد استفاده در این فرآیند یا مخصوص یک گونه یا ژن هستند یا برای انواع مایکوپلاسما عمومیت دارند. این روش سریع، کارآمد، قابل اعتماد و مقرون به صرفه است.
• روش حسگر مبتنی بر سلول از سلول‌­های مخصوصی استفاده می­کند که می‌­توانند وجود مایکوپلاسما را در کشت تشخیص دهند. هنگامی که این سلول‌­ها مایکوپلاسما را شناسایی می­کنند، یک سری واکنش­‌های شیمیایی را آغاز می­کنند و باعث تغییر رنگ قابل توجهی می­شوند. این روش دارای حساسیت بالاست اما مخصوص گونه­‌ها یا ژن­‌های زیادی نیستند.
• کیت‌های سنجش بیولومینسانس (Bioluminescence assay kit) که توسط شرکت‌های مختلف بیوتکنولوژی تولید می­شوند، کیت‌های تشخیص مایکوپلاسما مبتنی بر آنزیم هستند. این کیت­‌ها، آنزیم‌­های مایکوپلاسما را شناسایی می­کنند که توسط سلول‌­های یوکاریوتی (Eukaryotic cells) سنتز نمی‌­شوند. ابتدا مایکوپلاسما توسط اجزای کیت پاره می­شود، سپس با استفاده از آنزیم‌های خاصی، مکانیسم‌های سلولی ایجاد می­شود که منجر به تولید لومینسانس می­شود. سپس می­توان آلودگی را با یک لومینومتر تشخیص داد.
• برای تشخیص مایکوپلاسما می­‌توان رنگ­‌های غیر اختصاصی DNA را به محیط کشت آلوده اضافه کرد. با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده می­‌شود که DNA مایکوپلاسما به صورت مجزا از DNA سلولی و به شکل خوشه­‌های کوچک ظاهر می­شود.
• رنگ‌آمیزی DNA فلورسنت (Fluorescent DNA staining) یکی دیگر از جایگزین‌های رنگ‌آمیزی DNA است. در این روش از رنگ­‌های DNA مانند DAPI و Hoechst 33258 برای رنگ آمیزی تمام DNA استفاده می­‌شود. مقداری تخصص در این فرآیند مورد نیاز است زیرا تفسیر نتیجه ممکن است دشوار باشد. چگالی کم مایکوپلاسماها، آلودگی توسط باکتری‌­های دیگر یا سیگنال­‌های فلورسنت خارج سلولی تولید شده توسط این باکتری‌­ها می‌­توانند مانع تفسیر صحیح نتایج شوند. همچنین سیگنال‌­های ناحیه هسته‌­ای، تشخیص مایکوپلاسما را دشوار می­کند.

پیشگیری از آلودگی مایکوپلاسما

بهترین و مهم­ترین راه برای پیشگیری از مایکوپلاسما، ارائه آموزش و راهنمایی مناسب به افراد شاغل در آزمایشگاه است. این کار را می‌­توان با آموزش کارکنان واجد شرایط برای فرآیند کشت سلولی انجام داد و با این کار یکی از علل آلودگی را از بین برد.

در صورت امکان باید یک آزمایشگاه جداگانه برای کشت سلولی و نگه­داری رده­‌های سلولی ایجاد شود. فراهم کردن چنین محیطی برای تجهیزات آزمایشگاهی نه تنها آلودگی مایکوپلاسما را کاهش می­دهد بلکه از سایر آلودگی­‌های باکتریایی و قارچی نیز جلوگیری می­کند.

• تجهیزات حفاظت فردی مناسب (Personal protective equipment (PPE))

از آنجایی که انسان­‌ها منبع اصلی آلودگی هستند، مراحل پیشگیری از شما شروع می­شود. اگر به اندازه کافی مراقب باشید که محیطی استریل برای کار فراهم کنید، خیلی زود قبل از این­که متوجه شوید، این امر به یک عادت تبدیل می‌شود. در این­جا چند کار برای انجام وجود دارد:

• در حین کار با خطوط سلولی از روپوش و ماسک آزمایشگاهی تمیز استفاده کنید.
• از گفتگو با سایر اعضای آزمایشگاه، عطسه یا سرفه در آزمایشگاه خودداری کنید. دهان انسان حاوی طیف گسترده­ای از مایکوپلاسماها است و این مایکوپلاسماها می‌توانند هنگام صحبت، خنده، عطسه یا سرفه وارد کشت سلولی شوند.
• هنگام کار از دستکش استفاده کنید و پس از استفاده آن را دور بیندازید. هنگامی که بدون دستکش یا ماسک کار می­کنید، تماس انسانی می‌تواند باعث ایجاد آلودگی شود. مطمئن شوید که دستکش‌ها و ماسک‌ها را به‌جای این­که در جیب‌های روپوش‌­های آزمایشگاهی خود قرار دهید، مرتباً تعویض کنید.
• برای جلوگیری از ورود آلاینده‌های محیطی، کفش جداگانه‌ای برای آزمایشگاه داشته باشید.

رده‌های سلولی و شناسا­گرها

• قبل از استفاده رده سلولی خود را از نظر آلودگی به مایکوپلاسما بررسی کنید.
• اطمینان حاصل کنید که هیچ گونه آلودگی در سرم مورد استفاده برای زیرکشت وجود ندارد. از به کار گیری محصولات تاریخ مصرف گذشته یا شناسا­گرهایی که برای مدت طولانی‌تری نگهداری شده‌­اند، خودداری کنید.
• تا حد امکان از ظروف تازه و آن­‌هایی که محکم مهر و موم و بسته­‌بندی شده‌­اند، استفاده کنید.
• برای جلوگیری از آلودگی متقاطع از پیپت‌­های یکبار مصرف استفاده کنید.
• اطمینان حاصل کنید که تمام تجهیزات و شناساگر­های مورد نیاز را قبل و در حین کار در محیطی که جریان هوای لامینار وجود دارد، نگه دارید.
• قبل از استفاده از رده­‌های سلولی برای آزمایش یا اهداف تحلیلی دیگر، بررسی­‌های معمولی را برای آلودگی مایکوپلاسما انجام دهید.
• به جای استفاده از فیلترهای 0.2 میکرونی برای فیلتراسیون محیط، از فیلترهای 0.1 میکرون استفاده کنید، زیرا راه بهتری برای جلوگیری از مایکوپلاسما می‌­باشد. هیچ اطمینان 100٪ وجود ندارد که این فرآیند می­تواند از آلودگی جلوگیری کند، اما این کار یک عمل بسیار خوب برای پیشگیری از آلودگی است.
• مقدار کمی از ذخایر محیط کشت را برای آزمایش آماده کنید. زیرا این کار از آلودگی بقیه محیط جلوگیری می­کند.
• از قرار دادن طولانی مدت کشت سلولی در معرض هوا خودداری کنید و قبل از قرار دادن آن­ها در انکوباتور، درب بالن را محکم کنید. با این کار مشکل آلودگی از طریق آئروسل­‌ها حل می­شود.
• عمل کشت را بدون استفاده از آنتی­بیوتیک انجام دهید زیرا استفاده از آنتی­‌بیوتیک­‌ها می‌­تواند منجر به افزایش مقاومت مایکوپلاسما نسبت به آنتی­‌بیوتیک­‌ها شود. آنتی‌­بیوتیک‌­ها باید فقط برای از بین بردن مایکوپلاسماها استفاده شوند و نه برای جلوگیری از رشد آن‌­ها. همچنین استفاده طولانی مدت از یک آنتی­بیوتیک خاص می­تواند باعث مقاوم شدن سایر باکتری­‌ها به غیر از مایکوپلاسما شود.
• همیشه ذخایری به شکل ویال‌های منجمد شده از رده‌­های سلولی داشته باشید، حتی اگر زیست‌­پذیری سلول‌­های منجمد شده با هر زیرکشت کاهش یابد.

تجهیزات آزمایشگاهی

• دستگاه جریان هوای لامینار و تاسیسات آزمایشگاهی را به صورت دوره­ای ضد عفونی کنید.
• انکوباتورهای CO2 که برای حفظ رده­‌های سلولی استفاده می­شوند، نباید بیش از حد پر شوند (بیش از 60 درصد ظرفیت آن)، زیرا می­‌تواند باعث سرایت آلودگی مایکوپلاسما از یک رده سلولی به رده سلولی دیگر شود.
• چندین رده سلولی نباید در یک انکوباتور ذخیره شوند زیرا خطر آلودگی متقاطع را افزایش می­‌دهد.
• انکوباتورهای CO2باید به طور منظم تمیز شوند و از هر نوع رطوبتی باید اجتناب شود. آب مقطر تهیه شده برای حفظ رطوبت، باید به طور منظم تعویض شود زیرا مایکوپلاسماها، باکتری­‌ها و قارچ‌­ها می‌­توانند به این ظروف وارد شوند.
• هر محیط کشت ریخته شده را فوراً پاک کنید.
• حمام‌­های آب، ظروف نیتروژن مایع، بطری‌­های شناسا­گرها و سایر منابع عفونت باید به طور مرتب تمیز شوند و به طور دوره­ای از نظر آلودگی بررسی شوند.

حذف مایکوپلاسما پس از تشخیص

بعد از این که آلودگی مایکوپلاسما را پیدا کردید، چه باید کرد؟ بهترین راه دور انداختن فلاسک‌های کشت سلولی آلوده است. در مواردی که کشت‌­ها غیر قابل جایگزین کردن یا بسیار گران هستند، راه‌هایی برای حفظ آن­‌ها وجود دارد.  

شکل 3: محیط کشت آلوده

حذف آلودگی یک فرآیند بسیار زمان­‌بر است و خطر سرایت آلودگی به سایر خطوط سلولی سالم را افزایش می­‌دهد. مواد حذف مایکوپلاسما (Mycoplasma Removal Agents (MRA)) مشتقاتی از خانواده آنتی‌بیوتیک‌های کینولون (quinolone) هستند و آنتی‌بیوتیک‌هایی با طیف وسیع هستند. از این مواد می­‌توان برای شستشوی کشت­‌های سلولی استفاده کرد.

بسته به شدت عفونت، فرایند حذف ممکن است از چند هفته تا چند ماه طول بکشد. پلاسموسین (Plasmocin) یک داروی پرمصرف است که می­‌تواند بیشتر مایکوپلاسماهای موجود در محیط کشت را از بین ببرد. همچنین داروهایی مانند BM Cyclin، fluoroquinolone ciprofloxacin، ciprobay، zagam، baytril،  tetracycline و غیره برای حذف مایکوپلاسما از کشت آلوده در دسترس هستند.

MRA­ها غیر سمی و موثر در زمینه از بین بردن بیشتر آلودگی‌­های مایکوپلاسما هستند، به راحتی قابل استفاده بوده و برای طیف وسیعی از مایکوپلاسما­ها موثر می‌­باشند. این روش­‌ها نمی­‌توانند حذف کامل مایکوپلاسما را تضمین کنند، اما می‌­توانند اکثر آلودگی­‌های مایکوپلاسماها را از بین ببرند و آخرین راه کمکی هستند.

در این فرایند معایبی نیز وجود دارد، زیرا طول مدت فرایند حذف می‌تواند بر رشد و بقای سلول تأثیر بگذارد. اگر مایکوپلاسماها آسیب دائمی به کشت سلولی وارد کرده باشند، غیر قابل جبران است. برخی از سلول‌ها ممکن است به دلیل دوره‌های انکوباسیون طولانی‌تر بمیرند و بر روی زنده ماندن کل سلول‌­ها تأثیر بگذارند.  

نتیجه گیری

به طور خلاصه، همیشه پیشگیری از آلودگی نسبت به این­که بعد از آلودگی آن را از بین ببریم، مهم‌­تر است. وقتی مایکوپلاسما کشت سلولی شما را آلوده می­کند نترسید، زیرا شما اولین فردی نیستید که با این مسئله مواجه می­شود. در صورت امکان به دیگران آموزش دهید و به آن­ها کمک کنید اهمیت پیشگیری از آلودگی را درک کنند.   از دوره‌ کارآموزی کشت سلولی ژنیران دیدن فرمایید:

دوره مهارت آموزی کشت سلول

  منبع

مترجم: فاطمه فریادرس