آماده سازی سلول برای فلوسایتومتری

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر آماده سازی سلول برای فلوسایتومتری

فلوسایتومتری یک تکنیک محبوب است که برای اندازه گیری بیان مولکول‌ها، شناسایی سلول‌ها و تجزیه و تحلیل اندازه و حجم سلول استفاده می‌شود. این تکنیک معمولاً شامل برچسب زدن سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های فلورسنت یا لیگاندها می‌شود که به هدف‌های خاصی در سلولی که باید شناسایی شود، متصل می‌شوند.

انواع نمونه

ساده ترین نمونه ها برای آماده سازی برای فلوسایتومتری سلول های کشت معلق، میکروارگانیسم های موجود در آب، باکتری ها و مخمرها هستند. استفاده از خون کامل نیز نسبتاً آسان است، زیرا گلبول های قرمز را می توان با لیز حذف کرد و سپس انواع گلبول های سفید را شناسایی کرد.

سلول های منفرد برای فلوسایتومتری باید از بافت های جامد تولید شوند. این کار با تخریب بافت انجام می شود. تخریب مکانیکی برای بافت هایی که به صورت سست متصل هستند، مانند سلول های چسبنده کشت بافت، مغز استخوان و بافت لنفاوی، به خوبی کار می کند.

بافت همچنین می تواند توسط آنزیم ها تجزیه شود. در تجزیه آنزیمی، آنزیم‌ها برهمکنش‌های بین پروتئین‌ها و ماتریکس خارج سلولی را که سلول‌ها را کنار هم نگه می‌دارد، مختل می‌کنند. آنزیم‌ها بر اساس عواملی مانند pH، دما ،کوفاکتور و سایر عوامل انتخاب می‌شوند زیرا همگی بر عملکرد آنزیم‌ها تأثیر می‌گذارند.

رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس مستقیم و غیر مستقیم

تکنیک‌های رنگ آمیزی مختلفی برای فلوسایتومتری وجود دارد. از جمله آنها رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس است که می‌تواند مستقیم یا غیر مستقیم باشد. رنگ‌آمیزی مستقیم ایمونوفلورسانس شامل درمان سلول‌ها با یک آنتی‌بادی نشان‌دار فلورسنت است.

رنگ‌آمیزی غیرمستقیم گاهی اوقات تکنیک ساندویچ نامیده می‌شود که در آن معرف اولیه برچسب‌گذاری نمی‌شود، اما در عوض توسط یک معرف ثانویه که دارای برچسب فلوئوروکروم است، شناسایی می‌شود. هر دو این معرف‌ها می‌توانند آنتی بادی باشند،بطوری که آنتی‌بادی ثانویه دارای اختصاصیت و تمایل نسبت به آنتی‌بادی اولیه باشد.
به طور کلی، رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس آسان است، اما کیفیت ،اختصاصیت و شدت اتصال را می‌توان تحت تأثیر عوامل متعددی قرار داد.

رنگ آمیزی تک سلولی

رنگ آمیزی تک سلولی تکنیکی است که برای تشخیص آنتی ژن های سطحی استفاده می شود. بافت لنفوئیدی یا خون محیطی نمونه‌هایی هستند که می‌توان از آن سوسپانسیون های تک سلولی ساخت.

در این روش، سلول‌ها در لوله‌ها یا صفحات میکروتیتر (صفحه‌های مسطح با چاهک‌های زیاد که می‌توان برای نگهداری محلول‌ها استفاده کرد) با آنتی بادی انکوبه می‌شوند. آنتی بادی‌ها می‌توانند بدون برچسب یا با فلورسانس برچسب گذاری شوند. سپس سلول‌ها با محلول بافر شسته می‌شوند تا آنتی بادی‌هایی که به سلول‌ها متصل نشده اند حذف شود.

سوسپانسیون تک سلولی ممکن است برای تشخیص آنتی ژن های داخل سلولی نیز استفاده شود. این امر مستلزم آن است که غشای پلاسمایی اجازه دهد رنگ‌ها یا آنتی‌بادی‌ها موجود در سوسپانسیون‌های تک سلولی عبور کنند. این روش می‌تواند محتوای DNA سلول را به دقت اندازه گیری کند.

پروتکل‌های آماده‌سازی سلول‌ها برای سوسپانسیون تک سلولی جهت فلوسایتومتری را می‌توان باتوجه به آنتی‌ژن‌ها تغییر داد، این تغیر با توجه به حساسیت به دناتوره شدن یا نحوه اتصال آنتی‌بادی به آنتی‌ژن پس از نفوذپذیری سلول صورت می‌گیرد.

آنتی ژن‌های داخلی و سطحی یک سلول را می‌توان به طور همزمان با رنگ آمیزی سطح سلول برای بیان آنتی ژن و همچنین داخل سلولی برای بیان آنتی ژن اندازه گیری کرد. با این حال، نوع برچسب گذاری آنتی بادی مهم است، زیرا برخی از آنها مانند فلورسانس پریدینین کلروفیل (PerCP) پس از نفوذ به سلول از بین می‌روند.

رنگ آمیزی سلولی غیر زنده

سلول‌های غیر زنده یا سلول‌های مرده یکپارچگی غشاء خود را از دست داده اند. این بدان معنی است که آنها را نمی‌توان در آماده سازی سلول‌های ثابت یا نفوذ پذیر استفاده کرد. D aminoactinomycin- 7 یا AAD- 7 را می توان در اینجا استفاده کرد. فلورسنت AAD -7 می‌تواند به DNA متصل شود، اما می‌تواند با افزودن اکتینومایسین D یا AD که فلورسنت نیستند مسدود شود.

سلول‌های کشت بافت

تهیه سلول‌ها از کشت بافت عموما ساده تر از سوسپانسیون‌های تک سلولی است. سلول‌هایی که به صورت سوسپانسیون رشد می‌کنند را می‌توان به تدریج در یک لوله سانتریفیوژ ریخت، سانتریفیوژ کرد و مجدداً در بافر رنگ آمیزی فلوسایتومتری معلق کرد.

مطالب مرتبط:

منبع

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه