Real-Time PCR-بخش اول

آموزش کامل Real Time PCR :

تکنیک PCR روشی کاربردی است که در آن با استفاده از سیکل های دمایی پیوسته اقدام به تکثیر یک ناحیه از ژن می گردد. به این ترتیب که ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته DNA در دمای بالای 90 درجه ازهم باز شده، سپس دما تا حدود 60 درجه پایین آمده و پرایمر ها به تک رشته‌ای DNA در دو جهت مخالف متصل می شوند. سپس آنزیم POLYMERASE سر 3 پرایمر را شناخته و اقدام به ساخت رشته مکمل می کند. سه مرحله نام برده 40 سیکل تکرار شده و نهایتا از یک رشته الگوی اولیه دو به توان 40 محصول ساخته می شود.

برخلاف Traditional PCR و یا PCR سنتی که حضور و یا عدم حضور ژن هدف را تنها در انتهای واکنش مشخص می‌کند تکنیک PCR کمی لحظه به لحظه پیشرفت واکنش را رصد می‌کند. پیشرفت واکنش در روش qPCR از طریق افزایش در میزان سیگنال فلورسنت قابل تشخیص خواهد بود. ‌‌سیگنال‌های فلورسنت از طریق رنگ‌های فلوئوروفوری متصل شونده به رشته های DNA همچون رنگ سایبرگرین و یا توالی‌های پروب کونژوگه با رنگ فلوئوروفور مانند پروب taqman ساطع می‌شوند.

در روش سایبر، رنگ سایبرگرین زمانی که به توالی دو رشته‌ای متصل ‌شود؛ میزان فلورسنت بسیار قوی از خود ساطع خواهد کرد در ‌حالی که با اتصال آن به توالی تک رشته سیگنال بسیار ضعیفی انتشار می‌شود. نهایتا نتیجه آن می شود که با پیشروی سیکل ها از مرحله دناتوراسیون و در ادامه اتصال پرایمر و طویل سازی، محصولات دو رشته ای به تدریج افزایش یافته و سیگنال نوری حاصل از آن ها تشدید خواهد شد.

متداول ترین نوع پروب، taqman است که در این روش پروب قبل از اتصال پرایمر روی رشته قرار می‌گیرد و زمانی که آنزیم سنتز رشته را آغاز می کند با فعالیت ‘5 اگزونوکلئازی خود پروب را هیدرولیز می کند. پروب از یک سمت به رنگ گزارشگر و از سمت دیگر به خاموشگر اتصال دارد. با هیدرولیز پروب رنگ گزارشگر از خاموشگر جدا شده و شروع به انتشار سیگنال خواهد کرد. بنابراین هرچه میزان اولیه‌ی الگو بیشتر باشد تکثیر قطعات سریعتر پیش رفته، هیدرولیز پروب های اتصالی افزایش یافته و انتشار سیگنال توسط رنگ بیشتر خواهد شد.

دستگاه ترمال سایکلر به همراه یک منبع نوری و فلوریمتر با تاباندن نور به میکروتیوب های واکنش بازتابش رنگ را در هر reaction مانیتور کرده و منحنی تکثیر PCR را همگام با پیشرفت واکنش رسم می کند.

منحنی تکثیر از چهار فاز تشکیل شده است: فاز پایه، فاز تصاعدی، فاز خطی و فاز سکون.

در فاز پایه میزان سیگنال به حدی ضعیف است که قابل تشخیص از سیگنال های نویز نمی باشد. در فاز تصاعدی هر محصول در هر سیکل دو برابر شده و سیگنال به طرز تصاعدی افزایش می یابد. در چنین شرایطی گفته می شود بازدهی واکنش ۱۰۰ درصد است. کارایی بالای واکنش در این فاز، به دلیل فراوانی و تازگی اجزای واکنش است. در فاز خطی کارایی واکنش نسبت به فاز تصاعدی کاهش می یابد و در نهایت در فاز سکون واکنش متوقف شده و دیگر محصولی تولید نمی شود و سیگنال حاصل از رنگ گزارشگر ثابت می ماند.

از مرحله تصاعدی برای کمی کردن PCR و گزارش عددی از گراف استفاده می شود. به این منظور بالاتر از سیگنال پایه و در مرحله تصاعدی می توان با رسم یک خط فرضی سیکلی را که در آن گراف تکثیر از حد آستانه عبور می کند به عنوان عدد cq و یا ct اندازه گرفت. به وسیله عدد ctمی توان میزان فراوانی رونوشت های RNA حاصل از یک ژن را به صورت نسبی بین دو و یا تعداد بیشتری از نمونه ها ارزیابی کرد. همچنین می توان میزان هدف را به صورت مطلق در نمونه با استفاده از یک منحنی استاندارد حساب کرد.

صعود گراف در مرحله نمایی با میزان فراوانی رونوشت هدف در شروع واکنش رابطه مستقیم دارد. به این صورت که هرچه میزان الگوی اولیه بیشتر باشد صعود گراف سریعتر خواهد بود. با رسم خط آستانه روی گراف سیکلی که در آن واکنش به آستانه می رسد به دست می آید. این کمیت را CT یا سیکل ترشلد می نامیم. به بیان بهتر هرچه میزان الگوی اولیه بیشتر باشد میزان CT کمتر خواهد بود و بالعکس.

مواد مورد نیاز برای انجام واکنش ریل تایم جهت تعیین بیان ژن به وسیله گزارشگر پروب شامل:

مسترمیکس که خود دارای DNTP ، بافر mg و نمک های لازم جهت بهبود واکنش است
- پرایمر های فووارد و ریورس
- پروب
- آب
- نمونه

به جهت حساس بودن تکنیک، آزمایش برای هر نمونه حداقل دوبار تکرار می شود. بنابراین با توجه به تعداد نمونه، مخلوطی از آب مستر پرایمر و پروب را ترکیب کرده و به میزان مناسب با توجه به حجم واکنش بین میکروتیوب ها تقسیم می کنیم. در نهایت نمونه های cDNA مورد آزمایش را به هر well اضافه می کنیم. دقت شود هر نمونه دو بار مورد آزمایش قرار می گیرد و در صورت حصول ct یکسان از هر دو آزمایش نتیجه قابل قبول خواهد بود.

روی میکروتیوب ها را با سرپوش مناسب پوشانده اسپین کرده و در داخل دستگاه قرار می دهیم. برنامه دمایی مناسب را در نرم افزار دستگاه تعریف کرده و دکمه ران را می زنیم. بعد از گذشت چند دقیقه گراف تکثیر در نمایشگر کامپیوتر ظاهر شده و پیشرفت لحظه به لحظه واکنش را نشان می دهد.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه