ابزار و وسایل آزمایشگاهی شامل، محلول ها کیت ها، تکنیک ها، ویکی ژن
آگار تینسدال (Tinsdale): ترکیب، آماده‌سازی و موارد استفاده
مقدمه‌ای بر آگار تینسدال
محیط پایه آگار تینسدال توسط Tinsdale برای جداسازی و افتراق انتخابی کورینه‌باکتریوم دیفتری (C. diphtheriae) از دیفتروئیدها (Diphtheroid) ساخته شد. Billings بعداً محیط را اصلاح کرد و کیفیت‌های افتراق و تکرارپذیری آن را بهبود بخشید.
Moore و Parsons از محیط اصلاحی Billings استفاده کردند و ظهور یک هاله متمایز را تنها در اطراف کلنی‌های کورینه‌باکتریوم اولسرانس (C. ulcerans) و کورینه‌باکتریوم دیفتری ثابت کردند. آن‌ها همچنین محیط اصلاح شده تینسدال را به اندازه بلاد آگار سیستین-تلوریت (cystine-tellurite blood agar) برای جداسازی اولیه کورینه‌باکتریوم دیفتری از کشت‌های بینی و گلو، رضایت بخش یافتند. آن‌ها با این یافته‌ها، استفاده از محیط تینسدال اصلاح شده را برای جداسازی روتین کورینه‌باکتریوم دیفتری توصیه کردند.
ترکیب محیط پایه تینسدال اصلاح شده
|
مواد تشکیل دهنده |
گرم / لیتر |
| پپتیک دایجست بافت حیوانی (Peptic digest of animal tissue) | 20 گرم |
| کلرید سدیم (Sodium chloride) | 5 گرم |
| ال سیستین (L-Cystine) | 0.24 گرم |
| تیوسولفات سدیم (Sodium thiosulfate) | 0.24 گرم |
| آگار | 15 گرم |
pH برابر 0.2 ± 7.9 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد
مکمل تینسدال (برای 1 لیتر)
- سرم گاوی استریل: 100 میلی‌لیتر
- محلول تلوریت (1%) (Tellurite solution): 30 میلی‌لیتر
اصول آگار تینسدال
محیط تینسدال از رشد همه گونه‌های کورینه‌باکتریوم پشتیبانی می‌کند و در عین حال از رشد ارگانیسم‌های عادی ساکن در دستگاه تنفسی فوقانی جلوگیری می‌کند. تلوریت پتاسیم (Potassium tellurite) حاصل از مکمل، رشد تمام باکتری‌های گرم منفی و بیشتر فلور (flora) طبیعی دستگاه تنفسی فوقانی را مهار می‌کند.
ال سیستین و تیوسولفات سدیم، سیستم اندیکاتور H2S را تشکیل می‌دهند. رنگ سیاه کلنی‌ها ناشی از فعالیت تلوریت ردوکتاز (Tellurite reductase) است که منجر به کاهش تلوریوم (Tellurium) می‌شود، در حالی که هاله‌های قهوه‌ای نشان دهنده فعالیت سیستیناز (Cystinase) است. فقط C. diphtheriae و C. ulcerans کلنی‌های سیاه رنگ با هاله پیرامونی مشخص ارائه می‌دهند. سایر دیفتروئیدها، استافیلوکوک‌ها (Staphylococci) و برخی استرپتوکوک‌ها (Streptococci) نیز ممکن است تلوریت را کاهش دهند، اگرچه هاله در اطراف کلنی‌ها به طور کلی وجود ندارد.
پپتیک دایجست بافت حیوانی ترکیبات نیتروژن‌دار را فراهم می‌کند و آگار برای انجماد محیط است.
آماده‌سازی محیط تینسدال آگار
- 39 گرم از پودر محیط را در 1 لیتر آب مقطر بریزید و در حال هم زدن حرارت دهید.
- یک دقیقه آن بجوشانید.
- محیط را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو کنید.
- محیط پایه اصلاح شده را تا 50 درجه سانتی‌گراد خنک کنید و مکمل تینسدال را اضافه کنید.
- 15 تا 20 میلی‌لیتر از این محیط را در ظروف پتری (Petri) بریزید و اجازه دهید تا جامد شود.
محیط پایه آگار تینسدال بدون سرم و تلوریت اگر در لوله‌ها یا بطری‌های درپوش بسته نگه‌داری شود، به طور نامحدود پایدار است، اما پس از افزودن مکمل (سرم و تلوریت)، محیط فقط به مدت 2 تا 3 روز در صورت نگه‌داری در یخچال پایدار است.
روش
- پلیت (Plate) آگار تینسدال را برای به دست آوردن کلونی‌هایی به خوبی ایزوله، رگه بزنید.
توجه: توصیه می‌شود به آگار در فواصل زمانی ضربه بزنند زیرا قهوه‌ای شدن محیط را می‌توان زود (در طی 12-10 ساعت انکوباسیون) در نواحی ضربه زده شده، تشخیص داد.
- پلیت‌ها را در دمای 35 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور هوازی، انکوبه کنید.
توجه: اگر آگار تینسدال در هوای غنی شده با دی‌اکسید کربن انکوبه شود (به عنوان مثال در انکوباتور CO2)، ممکن است از رشد کورینه‌باکتریوم دیفتری جلوگیری شود.
- مورفولوژی کلونی را پس از 24 ساعت و 48 ساعت انکوباسیون بررسی کنید.
نتایج و تفسیر
وجود یک هاله قهوه‌ای در اطراف کلنی سیاه به عنوان شاهد احتمالی حضور C. diphtheriae در نظر گرفته می‌شود. گاهی اوقات این امر پس از 10 تا 12 ساعت انکوباسیون دیده می‌شود، اگرچه ممکن است 48 ساعت برای ظاهر شدن هاله‌های قهوه‌ای تیره معمولی لازم باشد. تنها گونه مرتبط به غیر از C. diphtheriae که این هاله را تولید می‌کند، C. ulcerans است. ایزوله‌هایی با این مورفولوژی کلنی ابتدا از نظر بیوشیمیایی به عنوان C. diphtheriae شناسایی می‌شوند و آزمایشات بعدی شامل نشان دادن تولید سم دیفتری است.
سایر باکتری‌ها مانند استافیلوکوک‌های کواگولاز مثبت (Coagulase-positive) در این محیط به خوبی رشد می‌کنند اما هاله قهوه‌ای ندارند. باکتری‌هایی مانند گونه‌های پروتئوس (Proteus) که یک سیاه‌شدگی شدید و منتشر شده در محیط را ایجاد می‌کنند، می‌توانند با واکنش رنگ‌آمیزی گرم (Gram) و ویژگی‌های بیوشیمیایی‌شان متمایز شوند.
همچنین بخوانید:
- محیط کشت VRBA (ویولت رد بایل آگار): ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
- محیط کشت CIN یا یرسینیا: اصول، ترکیب، روش آماده‌سازی و موارد استفاده
- مارتین لوئیس آگار (Martin Lewis Agar): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
- آگار YEPD: ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
مترجم: صادق حسینی‌کیا
