مقدمه‌ای بر استفاده از فلوسایتومتری برای تشخیص PIDs (نقص ایمنی اولیه)
برای درک بهتر مطالب بهتر است بدانید که نقص ایمنی چیست و چه انواعی دارد. نقص ایمنی ناشی از نقص یا عدم وجود عناصر سیستم ایمنی از جمله لنفوسیت ها، فاگوسیت ها و سیستم کمپلمان است.
دو نوع اختلال نقص ایمنی وجود دارد: آنهایی که با آنها متولد شده اید (اولیه) و آنهایی که اکتسابی هستند (ثانویه). هر چیزی که سیستم ایمنی شما را تضعیف کند می تواند منجر به اختلال نقص ایمنی ثانویه شود.
محققان دانشگاه فرایبورگ آلمان یک روش مبتنی بر فلوسایتومتری عملکردی را برای تشخیص نقص‌های ایمنی اولیه ذاتی (PIDs) توسعه داده‌اند. این تکنیک برای مونوسیت‌ها، که لکوسیت مدل سیستم ایمنی ذاتی است، انجام شد.
این آزمایش ابزاری است که می‌تواند اطلاعات عملکردی مانند بیان سایتوکاین و فعال شدن مسیر سیگنالینگ و همچنین حضور یا عدم حضور سلول‌های ایمنی بخصوص در شرایط کمبود وقت برای تصمیم گیری بالینی ارائه دهد.
فلوسایتومتری عملکردی مونوسیت، جایگزینی برای تشخیص نقص ایمنی اولیه ذاتی با استفاده از سنجش‌هایی است که غلظت سایتوکاین ها را با روش ELISA یا تیتر ویروسی تعیین می‌کند.( این روش‌ها معیاری برای کنترل میانگین تعداد سلول‌های فعال در هر نمونه ارائه نمی‌دهند).
روش فلوسایتومتری به ویژه برای کسانی که واریانت‌هایی با عملکرد نامشخص (VUS) دارند؛ مفید است.
واریانت‌ها با عملکرد نامشخص (VUS) اشکال مختلفی از یک ژن هستند که از طریق آزمایش ژنتیکی شناسایی شده‌اند و تأثیر نامشخصی بر سلامت ارگانیسم دارند. در غیاب سنجش‌های عملکردی معتبر برای تشخیص نقص‌های ایمنی ذاتی، فلوسایتومتری یک ابزار ارزشمند است. این تیم، فلوسایتومتری استاندارد آزمایشی مونوسیت را به منظور اعتبار سنجی کاربرد آن برای تشخیص نقص ایمنی اولیه ذاتی ، تنظیم کردند.
با این کار، تیم نمونه‌های بیمارانی که طیف وسیعی از کمبودها را نشان می‌دادند، تشخیص دادند. اول، برای بیماران مبتلا به نقص در گیرنده TLRو NOD2مسیرهای سیگنالینگ. این تیم سنجشی را انجام داد که میزان تولید TNF را اندازه گیری کرد.
به طور معمول، بیماران مبتلا به این وضعیت کاهش تولید TNF را در پاسخ به تحریک توسط لیپوپلی‌ساکارید (LPS) و L18-MDP نشان می‌دهند. MDP یک مشتق مصنوعی از مورامیل دی پپتید است که یک ترکیب پپتیدوگلیکان است و جز اصلی دیواره باکتری گرم مثبت و گرم منفی است و می تواند یک پاسخ التهابی ایجاد کند.
این تیم همچنین از این روش در بیماران مبتلا به بیماری التهابی روده زودرس یا مشکوک به کمبود مهارکنندهX -Linked آپوپتوز (XIAP) استفاده کردند.
برای تشخیص کمبود در پاسخ ناقص به IL-10، تیم آزمایش را با پیش انکوباسیون نمونه با IL-10 تطبیق دادند. این کار از تولید TNF که معمولاً توسط LPS القا می‌شود جلوگیری می‌کند. در نهایت، برای شناسایی بیماران مبتلا به نقص در نقص مسیر سیگنالینگ اینترفرون نوع I، تیم از یک روش مبتنی بر فلوسایتومتری استفاده کرد.
این روش شامل انکوباسیون سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PMBCs) با افزایش غلظت IFN-a بود. پس از این، سلول‌ها در یک محیط حاوی ویروس استوماتیت وزیکولار نوترکیب (VSV) که برای بیان یک پروتئین فلورسنت سبز (GFP) مهندسی شده بود، مجدداً معلق شدند و VSV-GFP را تولید کردند.
در پاسخ به تحریک IFN-a، کسری از PMBC ها که برای GFP رنگ‌آمیزی شده بودند، به عنوان معیاری از فعالیت اینترفرون نوع I در نظر گرفته شدند. کاهش پایدار در تعداد سلول‌های GFP مثبت به کمتر از 20 درصد به عنوان تأیید اهداکنندگان سالم بدون نقص ایمنی در نظر گرفته شد.
برای تشخیص بیمارانی که پاسخ ناقص به IL-10 دارند، این تیم سلول‌ها را با سایتوکاین با غلظت فزاینده انکوبه کردند. کاهش در تولید TNF اندازه گیری شد. آنها همین روش را در بیماران مبتلا به بیماری التهابی روده زودرس(IBD) انجام دادند. نتایج با استفاده از توالی‌های ژنتیکی برای جهش در ژن‌های کنترل کننده گیرنده‌های IL-10 تایید شد.
این تیم همچنین سه آزمایش فلوسایتومتری برای مونوسیت را انجام دادند که نتایج قابل تکراری را نشان داد؛ این نشان می‌دهد بیماران از جهش‌های از دست دادن عملکرد (loss of function mutations) در واسطه‌های سیگنال‌دهی ایمنی روی سطوح سلول‌ها رنج می‌برند.
این نتایج با استفاده از روش مهار IL-10، سنجش IFN-a که کمبود گیرنده IFN-a/b را تشخیص می‌دهد و سنجش L18-MDP که کمبودی در برهمکنش کمپلکس زنجیره یوبی‌کوئیتین و گیرنده سرین/ترئونین کیناز را نشان می‌دهد تأیید شد.
با این حال، این تست‌ها نیاز به اعتبار سنجی دارند، بنابراین تست‌های عملکردی که یکپارچگی مسیرهای سیگنالینگ ایمنی را تعیین می‌کنند، چندین مزیت دارند.
- اولین مزیت این است که، آنها می‌توانند نتایج را بین 24 تا 48 ساعت آماده کنند، که برای متخصصان مراقبت‌های بهداشتی که باید تصمیمات درمانی بگیرند، مناسب است.
- ثانیاً، نتایج به‌دست‌آمده عملکردی هستند و بر خلاف مورد VUS که اثرات عملکردی آن نیاز به تأیید دارد نیاز به تایید ندارند.
- ثالثاً، آزمایش‌های عملکردی می‌توانند کل مسیر سیگنال‌دهی را بررسی کنند و می‌توانند مولکول‌هایی را که معمولاً در فهرست پروتئین‌هایی که نشان‌دهنده نقص ایمنی اولیه ذاتی هستند گنجانده نمی‌شوند را هم مورد بررسی قرار دهند.
به طور معمول، توالی یابی کل اگزوم و تجزیه و تحلیل ژن موردنظر این مولکول‌ها را جا می‌اندازند. در نهایت، هزینه بررسی با روش های عملکردی مانند فلوسایتومتری که ارائه می‌شود اغلب از هزینه پرسنل و پردازش‌داده‌ها کمتر است. توجه داشته باشید که نقطه ضعف این نتایج عملکردی اتکای آنها به تایید ژنتیکی است (برخلاف غیر عملکردی)، اما زمانی که فلوسایتومتری عملکردی به عنوان بخشی از مسیر تشخیص انجام شود، این اتکا راحت‌تر است.
همچنین بخوانید:
مترجم: نسترن عاشوری
