الکتروفورز ژل آگارز: در این ویدیو لود کردن و ران کردن نمونه های DNA را جهت الکتروفورز با ژل آگارز یاد می گیرید. ژل الکتروفورز تکنیکی است که معمولاً در آزمایشگاه‌ها برای جداسازی مولکول‌های باردار مانند DNA, RNA و پروتئین‌ها باتوجه‌به اندازه‌هایشان انجام می‌شود. مولکول‌های باردار در طول ژلی که جریان الکتریکی از آن عبور می‌کند حرکت می‌کنند. جریان الکتریکی در سراسر ژل اعمال می‌شود به‌طوری‌که یک سر ژل دارای بار مثبت و انتهای دیگر دارای بار منفی است.

حرکت مولکول‌های باردار را اصطلاحاً، مهاجرت می‌گویند. مولکول‌ها به سمت بار مخالف حرکت می‌کنند؛ بنابراین یک مولکول با بار منفی به سمت انتهای مثبت کشیده می‌شود.ژل الکتروفورز از یک ماتریکس قابل نفوذ شبیه به غربال تشکیل شده است که وقتی جریان الکتریکی از آن عبور می‌کند، مولکول‌ها می‌توانند در طول آن حرکت کنند.

مولکول‌های کوچک‌تر سریع‌تر حرکت می‌کنند و بنابراین مسافت بیشتری نسبت به قطعات بزرگ‌تر طی می‌کنند و در مقابل قطعات بزرگ‌تر که آهسته‌تر مهاجرت می‌کنند، مسافت کوتاه‌تری را طی می‌کنند. در نتیجه مولکول‌ها بر اساس اندازه از هم جدا می‌شوند.

ترکیب و ساختار ژل آگارز

آگارز یک پلی‌ساکارید طبیعی است که از دیواره سلولی برخی جلبک‌ها استخراج می‌شود. وقتی آگارز در آب گرم حل می‌شود و سپس سرد می‌گردد، یک ماتریکس نیمه‌جامد و متخلخل تشکیل می‌دهد که به‌عنوان بستری برای جداسازی مولکول‌ها عمل می‌کند. اندازه منافذ ژل بر اساس غلظت آگارز متفاوت است؛ غلظت پایین‌تر آگارز (مثلاً 0.7%) منافذ بزرگ‌تری ایجاد کرده و برای جداسازی قطعات بزرگ DNA مناسب است، در حالی که غلظت بالاتر (مثلاً 2%) منافذ کوچک‌تری فراهم می‌کند که برای قطعات کوچک DNA یا RNA کاربرد دارد.

نحوه عملکرد الکتروفورز ژل آگارز

در این تکنیک، DNA یا RNA که به طور طبیعی بار منفی دارند (به دلیل گروه‌های فسفات در ساختار خود)، تحت تأثیر میدان الکتریکی به سمت قطب مثبت حرکت می‌کنند. ماتریکس ژل آگارز به عنوان یک فیلتر عمل می‌کند که سرعت حرکت مولکول‌ها را بر اساس اندازه آن‌ها تنظیم می‌کند. قطعات کوچکتر که توانایی عبور از منافذ ژل را دارند، سریع‌تر حرکت می‌کنند و فاصله بیشتری را طی می‌کنند، در حالی که قطعات بزرگتر کندتر حرکت می‌کنند و نزدیک‌تر به چاهک باقی می‌مانند.

مراحل اجرای الکتروفورز ژل آگارز

تهیه ژل

مقدار مشخصی از پودر آگارز را در بافر الکتروفورز (مانند TAE یا TBE) حل کرده و آن را گرم می‌کنند تا کاملاً شفاف شود.

محلول گرم را به قالب ریخته و شانه‌هایی برای ایجاد چاهک‌ها در آن قرار می‌دهند.

پس از سرد شدن و جامد شدن ژل، شانه‌ها برداشته می‌شوند.

آماده‌سازی نمونه

نمونه‌های DNA یا RNA با رنگ‌های بارگذاری (Loading Dye) مخلوط می‌شوند. این رنگ‌ها علاوه بر کمک به بارگذاری، حرکت نمونه‌ها را در حین الکتروفورز نشان می‌دهند.

بارگذاری نمونه‌ها

نمونه‌های آماده شده در چاهک‌های ژل بارگذاری می‌شوند.

یک مارکر اندازه‌گیری (DNA Ladder) نیز در یکی از چاهک‌ها بارگذاری می‌شود تا به عنوان مرجع اندازه استفاده شود.

اجرای الکتروفورز

ژل در تانک الکتروفورز قرار می‌گیرد و با بافر پر می‌شود.   – جریان الکتریکی اعمال می‌شود و مولکول‌های DNA یا RNA شروع به حرکت می‌کنند.

رنگ‌آمیزی ژل

پس از پایان الکتروفورز، ژل با استفاده از رنگ‌هایی مانند اتیدیوم بروماید (EtBr) یا SYBR Green رنگ‌آمیزی می‌شود تا قطعات DNA قابل مشاهده شوند.

مشاهده نتایج

ژل با استفاده از یک ترانس‌ایلومیناتور UV بررسی می‌شود و باندهای DNA یا RNA مشاهده و تحلیل می‌گردند.

الکتروفورز ژل آگارز و DNA

الکتروفورز به شما کمک می‌کند تا قطعات با طول‌های مختلف DNA را از یکدیگر تشخیص دهید.DNA دارای بار منفی است، بنابراین، هنگام اعمال جریان الکتریکی در ژل، DNA به سمت الکترود با بار مثبت مهاجرت می‌کند.رشته‌های کوتاه‌تر DNA، سریع‌تر از رشته‌های بلندتر، در ژل حرکت می‌کنند و در نتیجه قطعات به ترتیب اندازه مرتب می‌شوند.

استفاده از رنگ‌ها، برچسب‌های فلورسنت یا برچسب‌های رادیواکتیو باعث می‌شود  قطعات DNA پس از جداسازی از هم روی ژل قابل دیدن شوند و به‌صورت نوارهایی روی ژل ظاهر شوند.نشانگر DNA (DNA marker) با قطعاتی با طول‌های مشخص معمولاً هم‌زمان با نمونه‌ها از ژل عبور می‌کند.با مقایسه باندهای نمونه‌های DNA با نوارهای نشانگر DNA، می‌توان طول تقریبی قطعات DNA در نمونه‌ها را تعیین کرد.

تهیه ژل

ژل آگارز معمولاً برای تشخیص قطعات DNA استفاده می‌شود. غلظت آگارز مورد استفاده برای ساخت ژل به‌ اندازه قطعات DNA که با آن کار می‌کنید بستگی دارد.

هر چه غلظت آگارز بیشتر باشد، ماتریکس متراکم‌تر است و بالعکس. قطعات کوچک‌تر DNA در غلظت‌های بالاتر آگارز جداسازی می‌شوند در حالی ‌که مولکول‌های بزرگ‌تر به غلظت کمتری از آگارز نیاز دارند.

برای ساختن یک ژل، پودر آگارز را با یک بافر الکتروفورز مخلوط کرده و تا دمای بالا حرارت می‌دهند تا تمام پودر آگارز ذوب شود.

سپس ژل مذاب در یک کاست ژل ریخته می‌شود و یک شانه چاهک درانتهای آن قرار می‌گیرد تا چاهک‌هایی برای پیپت کردن نمونه‌ها ایجاد شود.

هنگامی که ژل سرد و جامد شد (به‌جای شفاف شدن، مات می‌شود)، شانه برداشته می‌شود.

امروزه بسیاری از افراد از ژل‌های آماده استفاده می‌کنند.

سپس ژل درون تانک الکتروفورز قرار می‌گیرد و بافر الکتروفورز در مخزن ریخته می‌شود تا سطح ژل پوشانده شود. بافر جریان الکتریکی را هدایت می‌کند. نوع بافر مورد استفاده به ‌اندازه تقریبی قطعات DNA نمونه بستگی دارد.

آماده‌سازی DNA برای الکتروفورز

قبل از الکتروفورز، رنگ به نمونه DNA اضافه می‌شود تا ویسکوزیته نمونه را افزایش دهد و از شناور شدن آن در چاهک‌ها جلوگیری کند و به ‌این ‌ترتیب حرکت نمونه در ژل قابل‌ مشاهده می‌شود.

یک نشانگر DNA  (که به‌عنوان یک سایز استاندارد و یا نردبان DNA نیز شناخته می‌شود( در اولین چاهک بارگذاری می‌شود. قطعات موجود در نشانگر دارای طول مشخصی هستند، بنابراین می‌توان از آنها برای تشخیص تقریبی اندازه قطعات نمونه‌ها استفاده کرد.

سپس نمونه‌های DNA آماده شده به چاهک‌های باقی‌مانده از ژل، پیپت می‌شوند.

هنگامی که این کار انجام شد، درپوش روی مخزن الکتروفورز قرار می‌گیرد و مطمئن می‌شویم که جهت ژل و الکترودهای مثبت و منفی درست قرار گرفته باشند (ما می‌خواهیم DNA از طریق ژل به انتهای مثبت مهاجرت کند.)

جداکردن قطعات الکتروفورز ژل آگارز

سپس جریان الکتریکی روشن می‌شود تا DNA با بار منفی از طریق ژل به سمت مثبت ژل حرکت کند.طول‌های کوتاه‌تر DNA سریع‌تر از طول‌های بلندتر حرکت می‌کنند، بنابراین در زمان برقراری جریان بیشتر حرکت می‌کنند.فاصله‌ای که DNA در ژل مهاجرت کرده است را می‌توان به ‌صورت بصری با نظارت بر حرکت رنگ بافر بارگذاری شده ارزیابی کرد.

جریان الکتریکی به‌ اندازه کافی روشن باقی می‌ماند تا اطمینان حاصل شود که قطعات DNA به ‌اندازه کافی در ژل حرکت می‌کنند تا از یکدیگر جدا شوند، اما نه آن‌قدر طولانی که از انتهای ژل خارج شوند.

الکتروفورز ژل آگارز

پدیدارشدن نتایج الکتروفورز ژل آگارز

هنگامی که DNA به‌اندازه کافی در سراسر ژل مهاجرت کرد، جریان الکتریکی قطع می‌شود و ژل از تانک الکتروفورز خارج می‌شود.برای تشخیص  DNA، ژل با فلورسنت متصل شده به DNA  رنگ‌آمیزی می‌شود و روی یک ترانسفورماتور فرابنفش قرار می‌گیرد که DNA رنگ‌آمیزی شده را به ‌صورت نوارهای روشن نشان می‌دهد.

همچنین می‌توان رنگ را قبل از ریختن با ژل مخلوط کرد.در ادامه اگر مراحل کار با ژل به‌ درستی انجام شده باشد، الگوی نواری نشانگر DNA قابل‌ مشاهده خواهد بود.سپس می‌توانید با فرض یک خط افقی بر روی نوارهای نشانگر DNA ، اندازه DNA را در نمونه خود تشخیص دهید. همچنین می‌توانید اندازه DNA های موجود را با تطبیق آنها با نزدیک‌ترین نوار نشانگر تخمین بزنید.

برای الکتروفورز با ژل آگارز می توان از تانک الکتروفورز نوع Mini-Sub Cell استفاده نمود. ساب سل دو سیم الکترود دارد که از انتهای دو طرف آن خارج شده است. این الکترود با تولید یک جریان الکتریکی مشخص موجب جدا شدن قطعات DNA در نمونه ما می شود.
اولین نکته ای که در قرار دادن ژل درون تانک حائز اهمیت می باشد، این است که چاهک ها در سمت الکترود منفی یا مشکی رنگ قرار بگیرند.

DNA بار منفی داشته و درون ژل از سمت الکترود منفی به سمت الکترود مثبت که قرمز رنگ است حرکت می کند.

ژل آگارز در Gel Chamber قرار داده می شود. سپس بافر الکتروفورز به مخازن بافر در در دو طرف Gel Chamber اضافه می شود. اضافه کردن بافر تا زمانی که دو میلیمتر بالاتر از چاهک های ژل را بپوشاند ادامه می یابد.

نمونه ها بر اساس ترتیب لود شدن در ژل آماده می شوند. جهت برداشتن نمونه و لود کردن آن با سمپلر ابتدا مقدار مشخص در آن ست شده، سپس شاسی آن تا step یک فشار داده شده و تیپ سمپلر وارد نمونه که شامل DNA است می شود. بعد به آرامی شاسی رها شده و نمونه وارد تیپ می گردد.

زمان لود کردن نمونه در چاهک های ژل، تیپ باید به شکل عمود وارد چاهک گردد. اهمیت عمود وارد کردن تیپ درون چاهک برای جلوگیری از احتمال سوراخ شدن ژل می باشد. حال جهت لود نمونه نوک تیپ تا زمانی که از سطح بافر عبور کند و دقیقا در بالای چاهک و یا درون چاهک قرار بگیرد، پایین آورده می شود.

شاسی سمپلر به آرامی فشار داده می شود تا نمونه وارد چاهک شود و اینکار تا زمان کامل پر شدن چاهک انجام می پذیرد. شاسی سمپلر ابتدا تا step یک فشار داده شده و پس از یک مکث کوتاه تا step دو فشار داده می شود تا تمام محتویات تیپ وارد چاهک شود. سپس با یک مکث کوتاه دیگر در حالی که هنوز شاسی سمپلر تا step دو فشار داده شده است، به آرامی تیپ از درون چاهک خارج می گردد.

پس از آنکه تمام نمونه ها در ژل لود شدند، به هیچ وجه تانک ژل تکان داده نمی شود. چرا که می تواند موجب ورود نمونه از یک چاهک به چاهک دیگر شود. با توجه به موقعیت صحیح قرار گرفتن الکترود ها در جای خود، درب تانک گذاشته می شود. الکترود ها بر اساس مثبت و منفی بودن و رنگ سیم هایشان به منبع انرژی متصل می گردد.

پس از روشن کردن منبع انرژی، مقدار ولتاژ بر اساس پروتوکل ست می گردد. اگر دستگاه دارای تایمر نیز باشد، می توان زمان مورد نیاز برای انجام الکتروفورز را بر اساس پروتوکل در آن وارد کرد. دکمه استارت زده شده و جریان درون الکترود ها و سپس درون بافر جهت جداسازی قطعات DNA برقرار می گردد.

پس از برقراری جریان، تشکیل حباب هایی که در مجاورت سیم های الکترود در دو انتهای تانک الکتروفورز قرار دارند، دیده می شود. قابل توجه است که تعداد حباب های تشکیل شده در سمت الکترود مثبت کمتر از الکترود منفی می باشد.پس از گذشت چند دقیقه مهاجرت نمونه ها از چاهک های خود به درون ژل دیده می شود. همانطور که مشخص است در نمونه های DNA در تکنیک الکتروفورز با ژل آگارز حرکت آن ها از سمت الکترود منفی به سمت الکترود مثبت می باشد.

کاربردهای الکتروفورز ژل آگارز

1. بررسی محصولات PCR

الکتروفورز ژل آگارز به‌طور گسترده برای تایید صحت و کیفیت محصولات PCR استفاده می‌شود. مشاهده باندهای DNA با اندازه‌های مورد انتظار نشان‌دهنده موفقیت PCR است.

2. جداسازی و تخلیص DNA

قطعات DNA پس از جداسازی می‌توانند از ژل استخراج شوند و برای مراحل بعدی مانند کلونینگ یا توالی‌یابی استفاده شوند.

3. تحلیل RNA

این روش برای بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج شده و اطمینان از عدم تخریب RNA مفید است.

4. بررسی تغییرات ژنتیکی

از الکتروفورز ژل آگارز می‌توان برای شناسایی موتاسیون‌ها یا تغییرات ژنتیکی استفاده کرد.

5. تحلیل نتایج کلونینگ

این روش برای تایید ورود پلاسمید یا ژن مورد نظر به میزبان در فرآیند کلونینگ کاربرد دارد.

مزایای الکتروفورز ژل آگارز

• سادگی: اجرای این روش نیاز به تجهیزات پیچیده ندارد و به راحتی در اکثر آزمایشگاه‌ها قابل انجام است.
• هزینه پایین: مواد و تجهیزات مورد نیاز برای این روش نسبتاً ارزان هستند.
• دقت: این روش امکان جداسازی دقیق قطعات DNA و RNA را بر اساس اندازه فراهم می‌کند.
• انعطاف‌پذیری: با تغییر غلظت ژل، می‌توان قطعات با اندازه‌های مختلف را جداسازی کرد.

محدودیت‌های الکتروفورز ژل آگارز

• قدرت تفکیک محدود: برای قطعات DNA یا RNA بسیار کوچک (زیر 50 جفت باز) یا بسیار بزرگ (بیش از 20 کیلوباز) مناسب نیست.
• محدودیت در تحلیل دقیق: این روش برای شناسایی توالی‌های خاص یا اندازه‌گیری دقیق غلظت مناسب نیست.
• استفاده از مواد شیمیایی خطرناک: برخی رنگ‌ها مانند اتیدیوم بروماید سمی و سرطان‌زا هستند و نیاز به احتیاط در استفاده دارند.

بهینه‌سازی و نکات کلیدی در اجرای الکتروفورز ژل آگارز

1. انتخاب غلظت مناسب ژل

برای قطعات بزرگ (1-20 کیلوباز): 0.7%-1% آگارز مناسب است.

برای قطعات کوچک (100-1000 جفت باز): 1.5%-2% آگارز بهتر است.

2. ولتاژ مناسب

ولتاژ بالا می‌تواند جداسازی را سریع‌تر کند اما ممکن است باعث داغ شدن ژل و از بین رفتن تفکیک باندها شود.

ولتاژ معمولی بین 5-10 ولت بر سانتی‌متر از طول ژل توصیه می‌شود.

3. بافر مناسب

بافرهای TAE و TBE از رایج‌ترین بافرها هستند. TAE برای جداسازی بهتر قطعات بزرگ و TBE برای جداسازی قطعات کوچک کاربرد دارد.

4. رنگ‌آمیزی ایمن

استفاده از رنگ‌های غیرسمی مانند SYBR Safe به جای اتیدیوم بروماید پیشنهاد می‌شود.

5. کنترل کیفیت

استفاده از مارکر اندازه‌گیری (Ladder) و نمونه‌های کنترل برای اطمینان از صحت آزمایش ضروری است.

نتیجه‌گیری

الکتروفورز ژل آگارز یک روش پایه و اساسی در زیست‌شناسی مولکولی است که با وجود سادگی و هزینه پایین، ابزار قدرتمندی برای جداسازی و مشاهده DNA و RNA فراهم می‌کند. این تکنیک با قابلیت‌های گسترده‌ای که دارد، از تحقیقات بنیادی تا کاربردهای کلینیکی و بیوتکنولوژی استفاده می‌شود. با این حال، برای نتایج بهتر و دقیق‌تر، رعایت نکات عملیاتی و استفاده از روش‌های مکمل مانند توالی‌یابی ضروری است.

همچنین بخوانید:

منبع