الکتروپوراتور: اصول، انواع، اجزا، موارد استفاده

فهرست مطالب نمایش

الکتروپوراتور وسیله‌ای است که در زیست‌شناسی مولکولی و مهندسی ژنتیک برای وارد کردن DNA، RNA یا سایر مولکول‌های خارجی به سلول‌ها با استفاده از پالس‌های الکتریکی استفاده می‌شود.

تاریخچه

در سال 1960 کشف شد که با اعمال یک میدان الکتریکی خارجی، پتانسیل غشایی (Membrane potential) بزرگتری در دو قطب یک سلول ایجاد می‌شود. در سال 1970 دانشمندان دریافتند که وقتی پتانسیل غشاء به سطح بحرانی برسد، غشاء می‌شکافد و بازیابی می‌شود. در سال 1980 دکتر Thomas C. Weaver و همکارانش الکتروپوراسیون (Electroporation) را با استفاده از همین اصل کشف کردند. اصطلاح الکتروپوراسیون برای توصیف فرآیندی ابداع شد که شامل میدان‌های الکتریکی برای ایجاد منافذی ناپایدار در غشای سلول بوده و به مولکول‌ها اجازه می‌دهد تا به غشای سلول وارد شوند.

اصول الکتروپوراسیون

هنگامی که پالس الکتریکی با ولتاژ بهینه برای چند میکروثانیه از طریق سوسپانسیون سلولی مربوط به سلول‌های میزبان و مولکول‌های انتخاب شده (مانند DNA) تخلیه می‌شود، لایه دوگانه فسفولیپیدی (Phospholipid) غشاء مختل می‌گردد. این امر منجر به تشکیل منافذی موقت می‌شود. سپس پتانسیل الکتریکی در سراسر غشاء افزایش می‌یابد که به مولکول‌های باردار مانند DNA اجازه می‌دهد تا از طریق منافذ وارد سلول شوند. این فرآیند مشابه الکتروفورز (Electrophoresis) است.

انواع الکتروپوراسیون

اساساً دو نوع اصلی الکتروپوراسیون بر اساس سلول‌های درگیر وجود دارد:

الکتروپوراسیون حجیم (Bulk electroporation)

الکتروپوراسیون تک سلولی (Single-cell electroporation)

الکتروپوراسیون حجیم: شامل الکتروپوراسیون حجم زیادی از سلول‌ها می‌شود. در این نوع الکتروپوراسیون، یک میدان الکتریکی همگن در یک سوسپانسیون سلولی اعمال می‌شود.
الکتروپوراسیون تک سلولی: شامل الکتروپوراسیون سلول‌های منفرد می‌شود و در مطالعات تک سلولی کاربرد دارد. در این نوع الکتروپوراسیون، یک میدان الکتریکی به صورت محلی در نزدیکی یک سلول ایجاد می‌شود.

به همین ترتیب، دو نوع اصلی بر اساس تنظیمات وجود دارد:

الف) الکتروپوراتورهای باز (Open electroporator)

ب) الکتروپوراتورهای بسته (Closed electroporator)

الکتروپوراتورهای باز: در این نوع الکتروپوراتور، کاربران می‌توانند تنظیماتی مانند طول پالس، شدت پالس، شکل موج و غیره را انجام دهند.
الکتروپوراتورهای بسته: در این نوع الکتروپوراتور کاربر باید تنظیمات از پیش طراحی شده را انتخاب کند.

به طور مشابه، دو نوع بر اساس نحوه عملکرد وجود دارد:

الکتروپوراتورهای افت نمایی (Exponential decay electroporator)

الکتروپوراتورهای موج مربعی (Square wave electroporator)

الکتروپوراتورهای افت نمایی: این الکتروپوراتورها پالس‌های الکتریکی تولید می‌کنند که شکل موجی با افت نمایی دارند. این پالس‌ها را می‌توان با تغییر تنظیمات ولتاژ و ظرفیت به منظور ایجاد یک گرادیان پالس (Pulse gradient)، بهینه کرد.
الکتروپوراتورهای موج مربعی: این الکتروپوراتورها یک پالس موج مربعی تولید می‌کنند. این پالس‌ها دارای ولتاژ، مدت زمان بین پالس‌ها، فرکانس پالس‌ها و زمان پالس هستند.

این دو بیشتر جهت اهداف الکتروپوراسیون مربوط به پستانداران استفاده می‌شوند. علاوه بر این، الکتروپوراتورهای تایم کانستنت (Time-constant) با پالس‌های ثابت زمانی توصیف می‌شوند که یک ولتاژ واحد را برای یک دوره زمانی تعیین‌شده ارائه می‌دهند.

اجزای اصلی الکتروپوراتور

منبع تغذیه: جزء اصلی این دستگاه است که انرژی الکتریکی را برای ایجاد میدان‌های الکتریکی فراهم می‌کند. ولتاژهای ارائه شده توسط منبع تغذیه از چند ولت تا چند کیلو ولت متغیر است. همچنین می‌تواند یک پالس کوتاه انرژی ایجاد کند.
مولد پالس: قطعه‌ای است که دامنه نوسان، مدت زمان و فرکانس پالس‌ها را کنترل می‌کند. دامنه نوسان، مدت زمان و فرکانس پالس پارامترهای مهمی برای یک الکتروپوریشن کارآمد هستند.
کووت‌ها (Cuvette): لوله‌های پلاستیکی یا شیشه‌ای یکبار مصرف برای نگهداری سلول‌ها و مولکول‌ها هستند. اندازه و طراحی آن‌ها ممکن است برای گنجاندن حجم نمونه‌های مختلف، متفاوت باشد. آن‌ها دو الکترود فلزی در دو طرف مقابل هم دارند که به رساندن پالس الکتریکی به سلول‌ها کمک می‌کنند.
الکترودها (Electrode): اجزایی هستند که برای رساندن پالس الکتریکی به سلول‌ها استفاده می‌شوند. هم‌ترازی مناسب الکترودها برای دستیابی به توزیع میدان الکتریکی یکنواخت در سراسر سلول‌ها مورد نیاز است.

مراحل انجام الکتروپوراسیون

اساساً الکتروپوراسیون شامل چهار مرحله است:

آماده‌سازی سلول: سلول‌ها با معلق کردن آن‌ها در بافر الکتروپوراسیون توصیه شده، آماده می‌شوند.
به کارگیری پالس الکتریکی: پالس الکتریکی باید در حضور بافر و اسیدهای نوکلئیک (Nucleic acid) روی سلول‌ها اعمال شود. در این مرحله یک پالس الکتریکی باعث ایجاد اختلاف پتانسیل در سراسر غشای سلولی می‌شود، بنابراین منافذ موقتی در غشاء ایجاد می‌شود که به ورود اسید نوکلئیک به سلول‌ها کمک می‌کند.
بازگردانی سلول‌ها به شرایط رشد: در این مرحله سلول‌ها به شرایط رشد برمی‌گردند و اجازه داده می‌شود تا بازیابی شوند.
سنجش سلولی: این بخش، مرحله نهایی است. در این مرحله سلول‌ها از نظر فرایند بیان ژن (Gene expression) یا خاموشی مورد سنجش قرار می‌گیرند.

کاربردها

سلول درمانی: یک الکتروپوراتور با قابلیت بقا و بازیابی سلولی خاص در سلول درمانی استفاده می‌شود.
ژن درمانی: پیشرفت‌های اخیر تکنولوژی، ژن درمانی را ایمن‌تر و کارآمدتر کرده است.
درمان سرطان: الکتروشیمی درمانی (Electrochemotherapy) بهترین کاربرد الکتروپوریشن در درمان سرطان است.
مهندسی ژنتیک (Genetic Engineering): الکتروپوراسیون روشی آسان و ساده برای انتقال ژن/پلاسمیدها (Plasmid) به سلول‌های باکتریایی است.
ترانسفکشن (Transfection): یک فرایند تطبیق‌پذیر است و می‌تواند برای ترانسفکشن DNA، RNA، mRNA، RNPs یا پروتئین‌ها در همه انواع سلول استفاده شود.

مزایای الکتروپوراتور

این ابزار از نظر زمانی کارآمد است، زیرا انجام آزمایش‌های ترافست یا تبدیل فقط چند دقیقه طول می‌کشد.
تطبیق‌پذیر است زیرا می‌توان از آن برای وارد کردن اجزای خارجی مانند DNA یا RNA یا پروتئین‌ها به انواع مختلف سلول مانند سلول‌های باکتری، مخمر، گیاه یا حیوان استفاده کرد.
راندمان ترافست یا تبدیل بالایی دارد.
الکتروپوراتور عاری از مواد شیمیایی سمی که می‌توانند به سلول‌ها آسیب برسانند یا بر روی بقای سلول تأثیر بگذارند، می‌باشد. این وسیله می‌تواند هم برای آزمایش‌های مقیاس بزرگ و هم برای آزمایش‌های مقیاس کوچک استفاده شود. به عنوان مثال، الکتروپوراتورهای حجیم برای حجم زیادی از سوسپانسیون‌های سلولی استفاده می‌شوند.
الکتروپوراتورها به کاربران این امکان را می‌دهند که شرایط الکتروپوراسیون را بر اساس نیاز تنظیم کنند.
به هیچ وکتوری (Vector) نیاز ندارد.
کمتر به نوع سلول وابسته است.
نتایج قابل تکرار هستند.
با انواع سلول‌هایی که ترافرست آن‌ها دشوار است، به خوبی کار می‌کند.
استفاده از آن ساده و آسان است.

معایب الکتروپوراتور

این وسیله نیاز به پارامترهایی دارد که باید به دقت بهینه شوند.
این وسیله می‌تواند گران باشد، به خصوص الکتروپوراتور با ویژگی‌های پیشرفته.
به تنظیمات پیچیده‌ای مانند الکتروپوراتورها، الکترودها و کووت‌ها نیاز دارد.
اگر یک پالس الکتریکی باعث آسیب سلولی شود، می‌تواند بر روی بقای سلولی تأثیر بگذارد.
بهینه‌سازی پارامترهای الکتروپوراسیون برای انواع سلول‌های مختلف گاهی اوقات می‌تواند زمان‌بر و چالش برانگیز باشد.

اقدامات احتیاطی هنگام استفاده

کووت‌ها و سانتریفیوژها باید قبل از استفاده در یخ سرد شوند.
سلول‌های الکتروکامپیتنت (Electrocompetent) باید روی یخ ذوب شده و خوب معلق شوند.
از افزودن حجم زیاد DNA خودداری کنید زیرا بازده تبدیل را کاهش می‌دهد.
DNA برای تبدیل باید عاری از نمک و پروتئین باشد.
الکتروپوراسیون باید بر اساس کووت‌ها و الکتروپوراتورها بهینه شود.
از غلظت بالای نمک‌ها یا حباب‌های هوا خودداری کنید زیرا ممکن است باعث ایجاد قوس الکتریکی شوند.
یک محیط بازیابی باید بلافاصله پس از الکتروپوراسیون به سلول‌ها اضافه شود. تاخیر می‌تواند بازده تبدیل را کاهش دهد.
پلیت‌های پتری (Petri plate) باید در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت از قبل گرم شوند تا بازده تبدیل بالاتری را انتظار داشته باشیم.

نمونه‌های الکتروپوراتور

الکتروپوراتور سلولی Eporator® (Eppendorf SE)

این الکتروپوراتور امکان رسیدگی سریعتر نمونه‌ها را با استفاده از یک دکمه واحد فراهم می‌کند.
این الکتروپوراتور یک رابط USB برای انتقال داده و GLP برای مستندسازی داده ارائه می‌دهد.
طراحی فشرده سبب شده تا فضای کمی را بگیرد و محدودیت ایمنی توسط نگه‌دارنده کووت یکپارچه به حداکثر می‌رسد.
نشانگرهای نمایشگر امکان داشتن عملکردی واضح را فراهم می‌کنند.

الکتروپوراتور سلولی NEPA21 (Bulldog Bio, Inc.)

این الکتروپوراتور در پالس‌های کوتاه و بلند ولتاژ پایین و قطبیت‌های معکوس برای ارائه امواج مربعی کامل با تقریباً عدم وجود اثرات سیتوتوکسیک (Cytotoxic)، عمل می‌کند.
طیف وسیعی از سلول‌ها، بافت‌ها و ارگانیسم‌ها را می‌توان با کارایی بالا ترافرست کرد.
این الکتروپوراتور به پالس منحصر به فرد غیر خازن محور وابستگی دارد.

الکتروپوراتور میکروپالسر (BioRad)

وجود سیستم خاموش کردن قوس الکتریکی (Arc quenching (ARQ)) باعث ایجاد قوس الکتریکی شده و از از دست رفتن نمونه‌ها جلوگیری می‌کند.
تکرارپذیری را می‌توان با ثابت زمانی و ولت‌های نمایش داده شده، حفظ کرد.
طیف گسترده‌ای از پارامترها را می‌توان به صورت دستی بهینه کرد. نشانگرهای پالس قابل شنیدن و همچنین قابل مشاهده هستند.

الکتروپوراتور موج افت نمایی BTX™ ECM™ 399 (fisherscientific)

این الکتروپوراتورها قابل حمل و کاربرپسند هستند و دارای ژنراتور ECM 399، پایه PEP™ (Personal Electroporation Pak) (قابل سفارش جداگانه) و کووت و قفسه کووت هستند.
قدرت میدان و طول پالس را با دقت تولید می‌کند.
همچنین دارای کنترل تک دکمه، ولتاژ پایین و بالا، صفحه نمایش بازخوانی LCD 16 کاراکتری، طول پالس و بازخورد ولتاژ اوج (Peak voltage) می‌باشد.

الکتروپوراتورهای موج دوقلو Gemini (BTX)

یک واحد از این الکتروپوراتور، الکتروپوراسیون موج مربعی و افت نمایی را ارائه می‌کند و برای کریسپر (CRISPR)، درون تنی (in vivo)، برون تنی (in vitro)، درون تخمی (in ovo) و اهداف دیگر ایده‌آل است.
سیستمی را برای کووت‌ها/ پلیت‌ها تایید می‌کند.
پروتکل‌هایی که به آسانی طراحی شده‌اند برای رایج‌ترین انواع سلول‌های یوکاریوتی (Eukaryotic) و پروکاریوتی (Prokaryotic) تنظیم شده‌اند در حالی که پروتکل‌های تعریف‌شده توسط کاربر توانایی افزودن و اصلاح آن‌ها را افزایش می‌دهند.

همچنین بخوانید: