ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری

مقدمه‌ای بر ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری

اگر به تکنیک ها و تست های مختلف تبیین شده در حوزه زیست فناوری نگاه کنیم، یک شباهت پایه‌ای بین تمامی این تکنیک ها خواهیم دید. عموماً هدف از انجام یک تکنیک زیست شناسی، شناسایی تفاوت های بین گروهی در موجودات زنده می باشد. ممکن است این تفاوت ها در سطح Whole organism باشد یا در سطح یک ماکرومولکول بررسی شود.

یعنی به عبارتی زیست شناسان همیشه دنبال پیدا کردن تفاوت های بین گروه های آزمایش خود در سطح موجود زنده کامل، بافت، سلول، میکروارگانیسم و ماکرومولکول می باشند. برای تشخیص این تفاوت ها نیاز به حضور یک تشخیص دهنده و یک اعلام کننده می باشد. یعنی یک عاملی باید وجود داشته باشد که تفاوت را تشخیص دهد و از طرف دیگر عامل دیگر آن تفاوت تشخیص داده شده توسط تشخیص دهنده را اعلام کند.

در تکنیک های IF و فلوسایتومتری، تشخیص دهنده آنتی بادی و اعلام کننده فلوروکروم هایی می باشند که بر اساس خاصیت بازنشری عملکرد دارند. یعنی به عبارتی یک آنتی بادی اختصاصی حضور یک آنتی ژن را در سطح یا داخل سلول تشخیص داده و سپس با رنگ فلوروکروم کنژوگه شده به خود، حضور آن آنتی ژن را اعلام می دارد.

تست IF در 2 سطح (سلول و بافت)، در 2 نوع (مستقیم و غیر مستقیم) و برای تشخیص 2 نوع مارکر های سلولی (غشاء و داخل سلول) می تواند کاربرد داشته باشد. در نوع بافت که تحت عنوان ایمونوهیستوفلورسنت می باشد، نمونه مورد استفاده یک بافت بیوپسی، اتوپسی، رادیکال یا توتال استخراج شده از یک موجود زنده کامل می باشد.

این بافت فرآیند های تثبیت، پردازش، قالب‌گیری و برش‌گیری را طی کرده و بر روی یک لام قرار می گیرد. سپس با آنتی بادی فلورسنت رنگ آمیزی شده و بررسی می شود. اما در حالتی که سلول های تحت کشت تست شوند، یک Monolayer سلولی وجود دارد و نیازی به برش نیست. لذا قبل از رنگ آمیزی فقط تثبیت سلولی انجام می شود.

در حالت مستقیم، آنتی بادی تشخیص دهنده آنتی ژن خود نشان دار شده و ترکیب فلوروکروم با آن کنژوگه شده است اما در حالت غیرمستقیم، آنتی بادی که با آنتی ژن اتصال اختصاصی دارد، نشان دار نشده است. پس از آن که آنتی بادی اولیه بدون فلوروکروم، به مارکر مورد نظر متصل شد، یک آنتی بادی ثانویه نشان دار فلورسنت که اتصال اختصاصی به آنتی بادی اولیه دارد، به آن متصل شده و تشخیص انجام می گردد.

عموماً در تست های IF یک آنتی بادی برای تشخیص استفاده می شود و در یک طول موج مشخص با بازنشر حضور آن مارکر را نشان می دهد. در کنار آن برای تشخیص محل قرار گیری سلول ها و بافت باید از یک رنگ زمینه‌ای فلورسنت مانند PI یا DAPI استفاده کرد. دسترسی به مارکر هایی که در سطح غشاء هستند بسیار آسان است اما اگر یک مارکر داخل سلولی یا سیتوپلاسمی هدف مطالعه باشد، منفذ دار کردن غشاء الزامی است.

تکنیک های IF و IHC جزء روش های دقیق ولی کیفی به حساب می آیند. به عبارتی در این تکنیک ها مشت نمونه خروار می باشد. یعنی اگر یک بافت با ضخامت، طول و عرض چند میلیمتر وجود داشته باشد، در این گونه مطالعات فقط یک section از آن بررسی می شود. برخلاف این روش ها تکنیک فلوسایتومتری علاوه بر دقت بالا، کمی بوده و تمام جامعه آماری را مورد بررسی قرار می دهد. به عبارتی در فلوسایتومتری، تمامی سلول های تیمار شده در دستگاه قرار گرفته و تک به تک مورد بررسی قرار می گیرند. لذا این امر دقت مطالعه را بسیار افزایش می دهد.

در روش فلوسایتومتری، بعد از اینکه سلول ها به دستگاه فلوسایتومتر تزریق شدند، در یک جریان خطی به حرکت در آمده و یک یا چند پرتو به آن ها تابانده می شود. براساس آنتی بادی ها و فلوروکروم های استفاده شده، بازنشر های مختلف به وجود آمده و به بخش detector دستگاه می رسند. در نهایت detector دستگاه با amplify کردن نتایج، میزان بازنشر هر سلول را مشخص می کند.

در بخش fluidic دستگاه فلوسایتومتر یک جریان مرکزی وجود دارد که سلول ها در آن قرار می گیرند. جریان مرکزی به همراه سلول ها در انتها با یک جریان مجاور مواجه می شود که جریان مجاور با ویسکوزیته بالای خود، یک فشار مشخصی را به جریان مرکزی وارد کرده و باعث تک خطی شدن سلول ها می شود.

در تست های IF و IHC در هر لام فقط یک مارکر یا نهایتا دو مارکر بررسی می شوند اما با توجه به تعداد کانال های دستگاه فلوسایتومتر تا 12 مارکر همزمان فقط در یک تست قابل بررسی است. در بخش optic دستگاه یک یا چند نور تکفام تولید می شوند که طول مناسب برای تهییج فلوروکروم های انتخاب شده در پنل آنتی بادی هستند. بعد ازبرخورد این نور ها به سلول، دسته‌ای از امواج بازتابی و بازنشری تولید می شوند.

امواج بازتابی، امواجی هستند که فقط به سلول خورده و منحرف شده‌اند. این امواج در دو دسته FSC (Forward Scatter Channel) و SSC (Side Scatter Channel) قرار می گیرند. نور های FSC شامل امواجی می باشند که در مسیر مستقیم با نهایت 20 درجه انحراف از سلول عبور کرده‌اند. نور های SSC نیز شامل امواجی هستند که 90 درجه منحرف شده‌اند. نور های FSC و SSC اطلاعاتی راجع به مارکر های سطح سلولی نمی دهند و نسبت آن ها فقط نشان دهنده ساختار سلول، اندازه، ناهمواری غشاء و گرانولیتی می باشد.

امواج بازنشری، نور هایی هستند که در اثر تهییج و بازنشر فلوروکروم های آنتی بادی های متصل شده به سلول بوجود آمده‌اند. نور های بازنشری همزمان اطلاعات چند مارکر را دارند و برای شناسایی دقیق اینکه بازنشر هر فلوروکروم چقدر بوده، از فیلتر ها و آینه های انتخابی مخصوص می گذرند و هر detector بازنشر فقط یک فلوروکروم را تشخیص می دهد.

در نهایت نتایج از detector به بخش amplifier دستگاه منتقل شده و مقادیر چند صد هزار برابر می شوند. نتایج فلوسایتومتری به شکل گرف در آمده و با توجه به ولتاژ دستگاه و شرایط آزمایش، بخش مثبت منفی بازنشر ها مشخص می شود. در نهایت نتایج در نمودار های نسبت FSC/SSC، تک پارامتری و دو پارامتری به نمایش در آمده و بر اساس درصد های مشخص شده نتیجه‌گیری انجام می شود.

در کلاس مهندسی بافت و پزشکی بازساختی آزمایشگاه ژنیران، هدف از انجام تست IF، شناسایی سلول های بنیادی مزانشیمی می باشد. چرا که در کشت سلول های بنیادی، یکی از اولیه ترین نکات، تست های تاییدی و اطمینان از بنیانیدگی می باشد. لذا پس از استخراج سلول های بنیادی مزانشیمی، یک مارکر مثبت و یک مارکر منفی به روش IF تست می شوند و پس از تایید مثبت بودن آن، مسیر پزشکی بازساختی ادامه داده می شود.

نویسنده: مسعود سلطانی حلوائی