باکتری های کلیفرم (Coliform): ویژگی‌ها، نمونه‌ها و روش شناسایی

مقدمه‌ای بر باکتری های کلیفرم (Coliform)

باکتری های کلیفرم گروهی از باکتری‌های گرم منفی، هوازی و بی‌هوازی اختیاری میله‌ای شکل بوده که حاوی آنزیم گالاکتوزیداز (Galactosidase) هستند که قادر به تخمیر اسید و گاز تولیدکننده لاکتوز می‌باشد. به آن‌ها باکتری کولی-آئروژن (Coli-aerogenes) نیز می‌گویند.

تعریف کلیفرم

سازمان جهانی بهداشت (WHO) کلیفرم را این گونه تعریف می‌کند: «باکتری‌های گرم منفی و میله‌ای شکل که قادر به رشد در حضور نمک‌های صفراوی یا سایر عوامل فعال سطحی با خواص بازدارنده رشد مشابه هستند و قادر به تخمیر لاکتوز در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد بوده و اسید، گاز و آلدئید (Aldehyde) در عرض 24 تا 48 ساعت تولید می‌کنند. آن‌ها همچنین اکسیداز منفی بوده و قادر به تولید اسپور (Spore) نیستند و فعالیت بتا-گالاکتوزیداز (β-galactosidase) را از خود نشان می‌دهند.

این گروه از باکتری‌ها در ابتدا فقط شامل 4 دسته از خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) بود: سویه‌هایی از دسته‌های اشریشیا (Escherichia)، انتروباکتر (Enterobacter)، کلبسیلا (Klebsiella) و سیتروباکتر (Citrobacter). در ابتدا طبقه‌بندی بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی و توانایی تخمیر لاکتوز بود، بنابراین تنها این 4 دسته به عنوان کلیفرم در نظر گرفته شدند.

اخیراً معیار طبقه‌بندی تغییر کرده و گروه کلیفرم اکنون با توانایی تولید آنزیم گالاکتوزیداز بر اساس تست o-نیتروفنیل-β-گالاکتوپیرانوسید (o-Nitrophenyl-β-galactopyranoside (ONPG)) و سایر ویژگی‌های مولکولی و آزمایش‌های بیوشیمیایی مانند IMViC تعریف شده است. در حال حاضر 19 دسته در گروه کلیفرم وجود دارد و همه آن‌ها از اعضای باکتر‌های انتروباکتریاسه هستند.

آئروموناس (Aeromonas) که متعلق به خانواده Aeromonadaceae است نیز به عنوان عضوی از گروه کلیفرم شناخته می‌شود، اما این امر به طور گسترده پذیرفته نشده است. آئروموناها همچنین ظرفیت تولید گالاکتوزیداز را دارند و بسیاری از گونه‌های آن لاکتوز را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تخمیر می‌کنند، اما این باکتری‌ها اکسیداز مثبت هستند. با این حال، تمام کلیفرم‌های دیگر اکسیداز منفی هستند.

تمام باکتری های کلیفرم در جدول زیر آمده است:

* گونه‌های آئروموناس (Aeromonas) نیز در برخی از منابع به عنوان کلیفرم آورده شده است.

در میان دسته‌های ذکر شده در بالا، اشریشیا، کلبسیلا، سیتروباکتر و انتروباکتر بیش از 90 درصد از دسته‌های عموماً ایزوله شده را تشکیل می‌دهند.

ویژگی‌های باکتری های کلیفرم

• باسیل‌های گرم منفی بدون اسپور
• باکتری‌های هوازی یا بی‌هوازی اختیاری
• تخمیر‌کننده لاکتوز همراه با تولید گاز و اسید در دمای 37 درجه سانتی‌گراد
• دارای آنزیم گالاکتوزیداز
• همه آن‌ها اکسیداز منفی هستند (به استثنای آئروموناس).

زیستگاه/اکولوژی باکتری های کلیفرم

کلیفرم‌ها در طبیعت همه جا و در تمام دنیا وجود دارند. آن‌ها معمولاً در خاک، آب، گیاهان در حال فاسد شدن و درون یا روی بدن موجودات زنده (حشرات، نرم‌تنان، مهره‌داران، گیاهان) به عنوان عوامل بیماری‌زا یا کومنسال (Commensal) یافت می‌شوند. آن‌ها دسته‌های اصلی باکتریایی در دستگاه گوارش حیوانات خون‌گرم هستند. از این رو بیشتر از مدفوع ایزوله می‌شوند. این باکتری‌ها در انسان عمدتا در دستگاه گوارش یافت می‌شوند. گونه‌های  اشریشیا کولی، کلبسیلا، سیتروباکتر، انتروباکتر، هافنیا، سراتیا و یرسینیا به وفور در دستگاه گوارش مهره‌داران یافت می‌شوند.

طبقه‌بندی باکتری های کلیفرم

گروه کلیفرم به 3 گروه تقسیم می‌شود:

1. کلیفرم توتال
2. کلیفرم مدفوعی
3. E. coli

کلیفرم توتال (Total Coliform (TC))

TC شامل تمام 19 دسته است. یعنی هم دسته‌هایی که در محیط آزاد مانند خاک، آب، گیاهان در حال فساد، سطوح گیاهی و غیره یافت می‌شوند و هم دسته‌هایی که در دستگاه گوارش حیوانات خون گرم یافت می‌شوند. این گروه عمدتاً شامل گونه‌هایی است که برای انسان غیر بیماری‌زا هستند (اما برخی از آن‌ها فرصت طلب هستند). آن‌ها معمولا شامل سویه‌هایی هستند که ماهیت مزوفیل (Mesophilic) دارند و نمک‌های صفراوی و دمای 44 درجه سانتی‌گراد را به سختی تحمل می‌کنند.

وجود آن‌ها در آب یا هر خوراکی دیگری نشان دهنده آلودگی از طریق هر منبع محیطی یا از طریق مدفوع (اما نه لزوماً) می‌باشد. با این حال وجود آن‌ها در هر خوراکی نشان دهنده خطر آلودگی از طریق عوامل بیماری‌زای احتمالی است.

کلیفرم مدفوعی (Fecal Coliform (FC)) / کلیفرم مقاوم به حرارت

کلیفرم مدفوعی زیرگروه دیگری از کلیفرم یا TC است که شامل دسته‌هایی از کلیفرم است که به طور خاص در دستگاه گوارش و مواد مدفوع حیوانات خون‌گرم و همچنین انسان یافت می‌شود. این ارگانیسم‌ها اکنون “کلیفرم‌های مقاوم به گرما” نامیده می‌شوند، زیرا می‌توانند در بدن به خوبی رشد کنند و لاکتوز را در دمای حدود 44 درجه سانتی‌گراد تخمیر کنند.

ویژگی خاص آن‌ها توانایی تحمل نمک‌های صفراوی و سایر عوامل سطحی مشابه و تخمیر لاکتوز است که اسید و گاز در دمای حدود 44 درجه سانتی‌گراد آزاد می‌کند.

وجود آن‌ها در آب یا سایر خوراکی‌ها نشان دهنده آلودگی با مدفوع انسان یا سایر حیوانات خون گرم است. وجود آن‌ها به معنی وجود حتمی عوامل بیماری‌زا نمی‌باشد، اما نشان دهنده پتانسیل بالاتر برای حضور آن‎ها می‌باشد.

FC حاوی دسته اشرشیا است که از مدفوع نشأت می‌گیرد. با این حال دسته‌های دیگری مانند کلبسیلا، انتروباکتر و سیتروباکتر وجود دارند که لزوماً در مدفوع یافت نمی‌شوند. از این رو، اکنون به آن‌ها کلیفرم مقاوم به گرما می‌گویند.

E. coli

E.coli یک زیر گروه از کلیفرم‌های مقاوم به گرما است که تنها شامل سویه‌های باکتری E. coli است. این باکتری‌ها، گونه اصلی کلیفرم است که به طور گسترده‌ای از آب و سایر خوراکی‌ها ایزوله می‌شود.

E. coli به طور کلی در دستگاه گوارش و مدفوع حیوانات خون گرم یافت می‌‍شود. از این رو وجود آن‌ها قویاً نشان دهنده آلودگی از طریق مدفوع است. چندین گونه از E. coli بیماری‌زا هستند و حضور آن‌ها به شدت حاکی از احتمال بالاتری از حضور عوامل بیماری‌زا می‌باشد.

کلیفرم به عنوان ارگانیسم‌های شاخص

کلیفرم‌ها به عنوان “ارگانیسم‌های شاخص” شناخته می‌شوند و به طور معمول برای نشان دادن کیفیت میکروبیولوژیکی آب و همچنین محصولات لبنی و سایر نوشیدنی‌ها، استفاده می‌شوند. جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی کلیفرم‌ها آسان است و حضور آن‌ها اغلب با سایر پاتوژن‌های بالقوه همراه است. از این رو از آن‌ها به عنوان یک ارگانیسم شاخص در آب استفاده می‌شود.

کلیفرم‌های مدفوعی همراه با سایر باکتری‌های مدفوعی به عنوان ارگانیسم‌های شاخص اصلی استفاده می‌شوند. وجود آن‌ها نشان دهنده آلودگی با مدفوع است. E. coli مهمترین کلیفرم به عنوان ارگانیسم شاخص است. وجود E.coli نسبت به سایر کلیفرم‌های مدفوعی بسیار خطرناک‌تر است. بیشتر سویه‌های E. coli غیر بیماری‌زا هستند، اما سویه‌های بیماری‌زایی مانند E. coli O157:H7 وجود دارند.

مطابق با دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت، E. coli یا سایر کلیفرم‌های مقاوم به حرارت نباید در آبی که برای آشامیدن یا توزیع در سیستم تامین آب جامعه در نظر گرفته شده است، وجود داشته باشد.

بیماری‌زایی باکتری های کلیفرم

بیشتر گونه‌های گروه کلیفرم برای انسان غیر بیماری‌زا هستند. برخی از گونه‌ها مانند اشریشیا، کلبسیلا، سیتروباکتر، انتروباکتر، هافنیا، سراتیا و یرسینیا برای انسان بیماری‌زا هستند و باعث عفونت‌های گوارشی و ادراری، سپتیسمی (Septicemia)، باکتریمی (Bacteremia) یا سایر عفونت‌های سیستمیک می‌شوند. شایع ترین عفونت یک اختلال گوارشی مانند اسهال است. E.coli و کلبسیلا شایع‌ترین پاتوژن‌های این گروه هستند.

نقش کلیفرم در فساد غذاها و نوشیدنی‌ها

چندین گونه کلیفرم وجود دارند که مسئول فساد غذاهای فاسد شدنی با رطوبت بالا مانند شیر و محصولات لبنی، آب میوه‌ها، سبزیجات و میوه‌ها هستند. آن‌ها همچنین مسئول فاسد شدن گوشت و فرآورده‌های گوشتی فرآوری نشده هستند.

آن‌ها معمولاً غذا را از طریق آب و گردانندگان مواد غذایی، آلوده می‌کنند. یا این که حیوانات مورد استفاده جهت تولید فراورده‌های گوشتی، از قبل آلوده هستند. آن‌ها شروع به تولید اسید و گاز می‌کنند و باعث ایجاد بو، لزجی و تغییر در بافت می‌شوند. E. coli، گونه‌های یرسینیا، کلبسیلا، سراتیا، کلویورا، پانتوئا معمولاً با فساد غذاها و نوشیدنی‌ها مرتبط هستند.

منبع باکتری های کلیفرم

آب آلوده منبع اصلی باکتری های کلیفرم است. این باکتری‌ها از طریق آب آلوده در مواد غذایی پخش شده و میزبان انسان را آلوده می‌کنند.

عمدتاً جانوران خون‌گرم مخزن کلیفرم‌های مدفوعی هستند. معمولا منبع اصلی آلودگی آب، مدفوع انسان و سایر مهره‌داران می‌باشد. علاوه بر این، خاک، گیاهان و مواد در حال پوسیدن مخزن کل کلیفرم‌ها هستند.

تشخیص باکتری کلیفرم

تشخیص باکتری های کلیفرم، به ویژه کلیفرم‌های مقاوم به حرارت، در آب آشامیدنی (هم فرآوری شده و هم بسته بندی شده و همچنین آب آشامیدنی که در جامعه از طریق خط لوله توزیع می‌شود) الزامی است. کلیفرم‌ها را می‌توان با روش‌های زیر تشخیص داد:

1. روش فیلتراسیون غشایی

این متد رایج‌ترین و ساده‌ترین روشی است که برای جداسازی کلیفرم‌ها از نمونه آب استفاده می‌شود. این روش وجود کلیفرم کل را می‌تواند تشخیص دهد، اما تنها وجود E. coli را مستقیماً تأیید می‌کند. برای تایید سایر گونه‌های کلیفرم، باید یک سری آزمایشات بیوشیمیایی انجام شود.

در این روش، آب از طریق یک فیلتر غشایی (معمولاً یک کاغذ صافی نیتروسلولزی (Nitrocellulose) با منافذ 0.45 میکرومتری) فیلتر می‌شود. در ادامه کاغذ صافی روی محیط کشت جامد شده قرار گرفته و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه می‌شود. سپس رشد میکروارگانیسم‌ها در محیط بررسی می‌شود. متداول‌ترین محیط‌های مورد استفاده در این فرآیند عبارتند از:

ام-اندو آگار (M-Endo Agar)، ائوزین متیلن بلو آگار (Eosin Methylene Blue (EMB) Agar) و ویولت رد بایل آگار (Violet Red Bile (VRBA) Agar).

• اطلاعات بیشتر درباره EMB آگار

این محیط‌ها نسبت به سایر محیط‌ها به دلیل انتخابی بودن برای باکتری‌های گرم منفی و این که محیط‌های اندیکاتور برای E. coli و باکتری‌های تخمیرکننده لاکتوز هستند، ترجیح داده می‌شوند.

2. روش محتمل‌ترین تعداد (Most Probable Number (MPN)) / تخمیر چند لوله‌ای

این روش یک روش متداول دیگری برای تشخیص آلودگی آب به کلیفرم کل می‌باشد. این فرآیند برای تشخیص کلیفرم نسبت به روش فیلتراسیون غشایی، پیچیده‌تر و پر زحمت‌تر است. با این حال تعداد تقریبی باکتری‌های زنده را ارائه می‌دهد و می‌تواند هر نوع باکتری دسته کلیفرم و همچنین سایر باکتری‌های غیرکلیفرم را شناسایی کند.

در این روش، نمونه آب در سه مرحله مختلف آنالیز می‌شود: (I) آزمون فرضی، (II) آزمون تاییدی، و (III) آزمون تکمیلی.

آزمون احتمالی مرحله غربالگری اولیه است که در آن فقط وجود یا عدم وجود باکتری‌های تخمیر کننده لاکتوز تولید کننده اسید و گاز، مورد مطالعه قرار می‌گیرد. بار تقریبی باکتری‌ها نیز در این مرحله شمارش می‌شود.

در آزمون تاییدی، بررسی می‌شود که آیا ارگانیسم تخمیرکننده لاکتوز که در آزمون فرضی شناسایی شده، باکتری کلیفرم است یا خیر. زیرا سایر باکتری‌های غیرکلیفرم نیز می‌توانند اسید و گاز تولیدکننده لاکتوز را تخمیر کنند. در نهایت در آزمون تکمیلی یک بار دیگر نتیجه آزمون تاییدی بررسی شده و وجود یا عدم وجود E. coli تایید می‌شود. اگر کلیفرم E.coli نباشد، برای شناسایی ارگانیسم نیاز به آزمایشات بیوشیمیایی بیشتری می‌باشد.

در این روش بیشتر از لاکتوز براث (تک و دو قدرته)، محیط کشت برلیانت گرین لاکتوز براث (Brilliant green lactose broth (BGLB))، محیط کشت ایندول (تریپتون واتر (Tryptone water))، EMB آگار یا ام-اندو آگار و نوترینت آگار (Nutrient Agar (NA)) استفاده می‌شود. اشکال اصلی این روش نیاز آن به مدت زمان طولانی‌تر، محیط و ابزارهای مختلف، پیچیدگی فرآیند و نیاز به آزمایش‌های بیشتر برای تشخیص دسته‌ها می‌باشد.

• اطلاعات بیشتر درباره تست MPN

3. کشت در محیط انتخابی

یک نمونه در محیط‌های انتخابی و شاخص مانند VRBA، EMB، MacConkey آگار، لاکتوز براث، ام-اندو آگار، کلیفرم آگار، کروموژنیک کلیفرم آگار و غیره برای تشخیص کلیفرم به ویژه E. coli تلقیح می‌شود.

4. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction (PCR))

این روش یکی از پیشرفته‌ترین و دقیق‌ترین روش‌ها برای تشخیص و تایید کلیفرم تا سطح زیرگونه‌ها، سروتیپ‌ها (Serovar) و زیرسویه‌ها می‌باشد. برای تایید هویت باکتری‌های ایزوله شده، DNA یا RNA آن‌ها آنالیز می‌شود. ژن کد کننده گالاکتوزیداز کلید شناسایی کلیفرم به روش PCR می‌باشد.

• اطلاعات بیشتر درباره Real-time PCR در تشخیص بیماری

5. هیبریداسیون درجای فلورسنت (Fluorescent in-situ Hybridization (FISH))

FISH یک تکنیک مولکولی جدید است که برای شناسایی چندین گونه کلیفرم از جمله E. coli، کلبسیلا، انتروباکتر و سیتروباکتر استفاده می‌شود. FISH از پروب‌های الیگونوکلئوتیدی (Oligonucleotide) خاصی برای تشخیص توالی‌های مکمل در ژن 16S rRNA کلیفرم استفاده می‌کند. این روش بسیار سریع و کارآمدتر از هر روش موجود دیگری برای تشخیص کلیفرم است. با این حال این روش پرهزینه بوده و به فلوروفور (Fluorophore)، میکروسکوپ فلورسنت و سایر ابزارها، فرآیندهای پیچیده و گران قیمت و میکروبیولوژیست‌های خبره نیاز دارد.

کیت‌های تجاری تشخیص کلیفرم

چندین کیت تجاری برای تشخیص کلیفرم‌ها در آب آشامیدنی موجود است. این کیت‌ها بر این اصل استوار هستند که کلیفرم‌ها لاکتوز را تخمیر کرده و اسید و گاز آزاد می‌کنند.

نقش باکتری های کلیفرم

1. نقش‌های مثبت

• می‌توانند به عنوان یک ارگانیسم اندیکاتور استفاده شود.

2. نقش‌های منفی

• پاتوژن‌های بالقوه
• شایع‌ترین آلاینده‌های آب و غذاها
• میتوانند باعث فاسد شدن شیر و لبنیات، سبزیجات و میوه‌ها شوند.

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا