مقدمه‌ای بر تست آگلوتیناسیون لاتکس
- هنگامی که یک آنتی‌ژن ذره‌ای یا نامحلول با آنتی‌بادی خود در حضور الکترولیت‌ها در دما و pH مناسب مخلوط می‌شود، ذرات آنتی‌ژن جمع شده یا آگلوتینه (Agglutinate) می‌شوند.
- واکنش‌های آگلوتیناسیون با عناوین واکنش‌های آگلوتیناسیون مستقیم، غیرمستقیم (غیرفعال) و غیرفعال معکوس طبقه‌بندی می‌شوند.
- تست آگلوتیناسیون مستقیم به سنجش‌هایی اشاره دارد که در آن آنتی‌ژن مستقیماً با آنتی‌بادی آگلوتینه می‌شود.
- آگلوتیناسیون غیرمستقیم یا غیرفعال شامل پوشش آنتی‌ژن بر روی سطح یک مولکول حامل (به عنوان مثال RBC، لاتکس یا بنتونیت (Bentonite)) است، به طوری که آنتی‌بادی به پوشش آنتی‌ژنی متصل شده و آگلوتیناسیون روی سطح مولکول حامل انجام می‌شود. این تست‌ها همچنین به عنوان “تست آگلوتیناسیون ذرات” نامیده می‌شوند.
- تست آگلوتیناسیون غیرفعال معکوس نوع خاصی از تست آگلوتیناسیون ذرات است که در آن آنتی‌بادی روی یک مولکول حامل را می‌پوشد و وجود آنتی‌ژن را در سرم بیمار شناسایی می‌دهد.
تست آگلوتیناسیون لاتکس
گروهی از تست‌های آگلوتیناسیون غیرفعال که با پوشش آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر روی یک ذره حامل مصنوعی به نام دانه لاتکس (Latex bead) انجام می‌شود، به عنوان تست آگلوتیناسیون لاتکس نامیده می‌شود. این تست‌ها ممکن است از سوی دیگر به عنوان تست تثبیت لاتکس شناخته شوند و ممکن است از نام‌های زیر استفاده شود:
تست آگلوتیناسیون لاتکس (LAT) برای تشخیص آنتی‌بادی: یک تست آگلوتیناسیون غیرفعال با آنتی‌ژن متصل به سطح دانه‌های لاتکس (ذرات لاتکس پلی‌استایرن (Polystyrene)؛ 0.8 تا 1 میکرومتر قطر) می‌باشد.
تست آگلوتیناسیون لاتکس (LAT) برای تشخیص آنتی‌ژن: یک تست آگلوتیناسیون غیرفعال معکوس با آنتی‌بادی متصل به سطح دانه‌های لاتکس می‌باشد.
اهداف تست آگلوتیناسیون لاتکس
تشخیص عفونت‌های میکروبی و ویروسی، بیماری‌های خودایمنی، هورمون‌ها، داروها یا پروتئین‌های سرم به وسیله واکنش آگلوتیناسیون آنتی‌ژن- آنتی‌بادی.
اصول تست آگلوتیناسیون لاتکس
مولکول‌های آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن را می‌توان به صورت تصادفی به سطح دانه‌های لاتکس (پلی‌استایرن) متصل کرد. تعداد مولکول‌های آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن متصل به هر ذره لاتکس زیاد است و در نتیجه تعداد زیادی محل اتصال بالقوه ظاهر می‌شود.
آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی موجود در یک نمونه به محل‌های ترکیبی آنتی‌ژن/ آنتی‌بادی مربوطه که روی سطوح دانه‌های لاتکس قرار گرفته‌اند، متصل می‌شود و توده‌ها با اتصال عرضی دانه‌های لاتکس و آنتی‌ژن/ آنتی‌بادی را ایجاد می‌کنند. اندازه ذرات بزرگ لاتکس تصویری‌سازی واکنش آنتی‌ژن- آنتی‌بادی را تسهیل می‌کند.
نیازمندی‌های تست آگلوتیناسیون لاتکس
- ویال‌های 1.5 میلی‌لیتری
- میکروسانتریفیوژ
- پیپت (Pipette)
- میکروتیپ
- یخچال آزمایشگاهی
- بافر نمکس گلایسین (Glycine)
- بافر مسدود کننده (Blocking buffer)
- آنتی‌ژن برای پوشش
- دانه‌های لاتکس
- آنتی‌سرم تستی
- لام‌های شیشه‌ای
- بشر آزمایشگاهی
- خلال دندان
مراحل تست آگلوتیناسیون لاتکس
روش معمول برای هر دو نوع تست لاتکس شامل پوشاندن ریزدانه‌های لاتکس با آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌های خاص پاتوژن است. مایع مغزی نخاعی، سرم یا ادرار بیمار با ذرات لاتکس پوشش داده شده در غلظت‌های ترتیبی با نرمال سالین (Normal saline) مخلوط شده و برای آگلوتیناسیون (توده شدن) بررسی می‌شود.
پوشاندن لاتکس (برای شناسایی آنتی‌بادی)
- به 20 میکرولیتر از دانه‌های لاتکس که با یک ویال 1.5 میلی‌لیتری برداشته شده است، 40 میکرولیتر بافر گلیسین-سالین (Glycine-saline) اضافه کنید.
- 60 میکرولیتر آنتی‌ژن به لاتکس اضافه کنید و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 ساعت انکوبه کنید.
- آن را به مدت 10 دقیقه در سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه قرار دهدید و مایع رویی را با دقت آسپیره (Aspirate) کنید.
- توده را مجدداً در 1 میلی‌لیتر بافر مسدود کننده معلق کنید و به مدت 10 دقیقه در سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه بچرخانید.
- یک بار دیگر شستشو را تکرار کنید.
- 90 میکرولیتر بافر مسدود کننده را به توده اضافه کنید و خوب مخلوط کنید.
- آن را به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
تست آگلوتیناسیون
- به 200 میکرولیتر بافر گلیسین-سالین که با یک ویال برداشته شده است، 4 میکرولیتر آنتی‌سرم تستی اضافه کنید. (50 بار رقیق شده).
- 50 میکرولیتر آنتی‌ژن را به 50 میکرولیتر آنتی‌سرم رقیق شده در ویال 1.5 میلی‌لیتری اضافه و خوب مخلوط نمایید و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- 10 میکرولیتر لاتکس پوشیده شده را به وسیله پیپت روی یک اسلاید شیشه‌ای قرار دهید.
- 10 میکرولیتر آنتی‌سرم تستی رقیق شده را به اسلاید A اضافه کنید.
- 10 میکرولیتر آنتی‌سرم مخلوط با آنتی‌ژن (از مرحله 1) به اسلاید B اضافه کنید.
- 10 میکرولیتر بافر گلیسین-سالین را به اسلاید C اضافه کنید.
- یک خلال دندان بردارید و محتوای هر اسلاید را مخلوط کنید. پس از استفاده در یک اسلاید، خلال دندان را دور بیندازید (برای اسلاید بعدی، از یک خلال دندان جدید استفاده کنید).
- پس از مخلوط کردن، 2 دقیقه صبر کنید تا نتیجه را مشاهده کنید.
نتایج و تفسیر تست آگلوتیناسیون لاتکس
بسته به روش، برخی از واکنش‌ها مثبت یا منفی گزارش می‌شوند و سایر واکنش‌ها در مقیاس +۱ تا +۴ درجه‌بندی می‌شوند. گرید +۲ معمولاً نشان‌دهنده حداقل مقدار آگلوتیناسیون قابل مشاهده در یک نمونه مثبت بدون کمک میکروسکوپ است.
مثبت: آگلوتیناسیون دانه‌ها که با ایجاد توده در هر یک از محلول‌ها مشهود باشد، یک نتیجه مثبت در نظر گرفته می‌شود.
این تست یا تایید می‌کند که بدن بیمار آنتی‌بادی مخصوص پاتوژن را تولید کرده است (اگر در تست آنتی‌ژن به دانه‌های لاتکس متصل باشد) یا اینکه نمونه حاوی آنتی‌ژن پاتوژن است (اگر در تست آنتی‌بادی به دانه‌های لاتکس متصل باشد).
منفی: بدون آگلوتیناسیون یا تشکیل توده.
عدم وجود آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی خاص پاتوژن.
کاربردهای تست آگلوتیناسیون لاتکس
- تست‌های لاتکس در آزمایشگاه‌های بالینی برای شناسایی آنتی‌ژن کریپتوکوکوس نئوفورمانس (Cryptococcus neoformans) در مایع مغزی نخاعی یا سرم بسیار متداول هستند. این تست همچنین برای شناسایی آنتی‌ژن‌های کپسولی پنوموکوک (Pneumococcus)، هموفیلوس آنفولانزا (Haemophilus influenzae) و مننگوکوک (Meningococcus) استفاده می‌شود.
- برای تایید وجود استرپتوکوک بتا همولیتیک (Beta-hemolytic Streptococcus) با استفاده از پلیت‌های (Plate) کشت.
- تست‌های لاتکس به‌طور مداوم برای شناسایی ارگانیسم‌های مختلف مانند شناسایی سموم کلستریدیوم دیفیسیل (Clostridium difficile) A و B، روتاویروس (Rotavirus) و اشریشیا کلی 0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7 ) از کلونی‌های مشکوک E coli در حال توسعه هستند.
- تست آگلوتیناسیون لاتکس با استفاده از دانه‌های لاتکس پوشیده شده با آنتی‌بادی‌های ضد CRP، پرکاربردترین روشی است که در سراسر جهان برای شناسایی پروتئین واکنشی C (C-reactive protein) استفاده می‌شود. حد تشخیص CRP با تست آگلوتیناسیون لاتکس 0.6 میلی‌گرم در دسی لیتر است.
- تست آگلوتیناسیون لاتکس (LAT) که برای شناسایی آنتی‌بادی به کار می‌رود، همچنین برای شناسایی ASO (آنتی‌بادی آنتی‌استرپتولیزین O (Antistreptolysin O)) استفاده می‌شود.
مزایای تست آگلوتیناسیون لاتکس
- اندازه دانه لاتکس (0.8 میکرومتر یا بزرگتر) سهولت تست را با نمودارکردن بصری واکنش آگلوتیناسیون افزایش می‌دهد.
- LAT یکی از پرکاربردترین تست‌های حال حاضر است، زیرا بسیار ساده و سریع است. اعتقاد بر این است که این تست جایگزین بسیاری از آزمایش‌های سرولوژیکی دیگر از جمله تست‌های کوآگلوتیناسیون (Co agglutination) شده است.
- آن‌ها ارزان و نسبتاً پایدار بوده و در معرض واکنش متقابل با سایر آنتی‌بادی‌ها نیستند.
- نشان داده شده است که سطوح پلی‌ساکاریدهای باکتریایی که توسط تست آگلوتیناسیون لاتکس شناسایی شده‌اند، به اندازه 0.1 نانوگرم در میلی‌لیتر هستند.
محدودیت‌های تست آگلوتیناسیون لاتکس
- از آن‌جایی که pH، اسمولاریته (Osmolarity) و غلظت یونی محلول بر میزان اتصالی که اتفاق می‌افتد تأثیر می‌گذارد، شرایطی که تحت آن پروسه تست آگلوتیناسیون لاتکس صورت می‌پذیرد، باید به دقت استاندارد شوند.
- برخی از اجزاء اصلی مایعات بدن، مانند فاکتور روماتوئید (Rheumatoid)، باعث ایجاد واکنش‌های مثبت کاذب در سیستم‌های لاتکس آگلوتیناسیون موجود می‌شوند.
- برخی از روش‌های آگلوتیناسیون نیاز دارند که در آن‌ها نمونه‌ها با حرارت دادن در دمای 56 درجه سانتی‌گراد یا با اتیلن‌دی‌آمین‌تترا استیک اسید (EDTA) قبل از انجام تست و تبدیل آن به یک فرآیند خسته کننده، آماده شوند.
همچنین بخوانید:
- تست CRP (پروتئین واکنشی C): اساس، موارد استفاده، روش و تفسیر نتایج
- تیتر آنتی بادی چیست؟ هدف، روش انجام، تفسیر
- تست آنتی بادی چیست؟
- آنتی بادی (Antibody) چیست؟
مترجم: صادق حسینی‌کیا
