مقدمه‌ای بر تست استفاده از سیترات
در میان مجموعه تست‌های IMViC (Indole، Methyl-Red، Vogues-Proskauer و Citrate) این تست برای افتراق بین باسیل‌های گرم منفی در خانواده باکتری‌های انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) استفاده می‌شود.
اصول تست استفاده از سیترات
در این تست از سیترات آگار (Citrate agar) برای آزمایش توانایی ارگانیسم در استفاده از سیترات به عنوان منبع انرژی استفاده می‌شود. محیط کشت حاوی سیترات به عنوان تنها منبع کربن و نمک‌های آمونیوم غیر آلی (NH4H2PO4) به عنوان تنها منبع نیتروژن می‌باشد.
باکتری‌هایی که می‌توانند روی این محیط رشد کنند، آنزیمی به نام سیترات پرمئاز (Citrate-permease) تولید می‌کنند که قادر به تبدیل سیترات به پیرووات (Pyruvate) است. سپس پیرووات می‌تواند برای تولید انرژی وارد چرخه متابولیک ارگانیسم شود. رشد ارگانیسم نشان دهنده استفاده از سیترات به عنوان یک متابولیت میانی در چرخه کربس (Krebs) می‌باشد.
هنگامی که باکتری‌ها سیترات را متابولیزه می‌کنند، نمک‌های آمونیوم به آمونیاک تجزیه می‌شوند که قلیاییت را افزایش می‌دهد. تغییر pH، نشانگر برومتیمول بلو (Bromothymol blue) در محیط را از رنگ سبز به آبی در pH بالاتر از 7.6 تبدیل می‌کند.
Christensen یک محیط تست سیترات جایگزین ایجاد کرد که در آن نیازی به ارگانیسم جهت استفاده از سیترات به عنوان تنها منبع کربن ندارد. محیط کشت Christensen حاوی پپتون و سیستئین (Cysteine) است.
بنابراین باکتری‌های سیترات منفی نیز می‌توانند در این محیط رشد کنند. یک واکنش مثبت نشان می‌دهد که ارگانیسم می‌تواند از سیترات استفاده کند اما نه لزوما به عنوان تنها منبع کربن.
محیط کشت مورد استفاده در تست استفاده از سیترات
سیمون سیترات آگار (Simmon’s Citrate Agar)
|
ترکیبات |
|
| سدیم کلرید | 5.0 گرم |
| سیترات سدیم (دهیدرات) | 2.0 گرم |
| آمونیوم دی هیدروژن فسفات | 1.0 گرم |
| دی پتاسیم فسفات | 1.0 گرم |
| سولفات منیزیم (هپتا هیدرات) | 0.2 گرم |
| بروموتیمول بلو | 0.08 گرم |
| آگار | 15.0 گرم |
آب دیونیزه = 1000 میلی لیتر
pH نهایی 0.2±6.9 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد.
روند آماده سازی
- نمک‌های ذکر شده در بالا را در آب دیونیزه حل کنید.
- pH را روی 6.9 تنظیم کنید.
- آگار و بروموتیمول بلو را اضافه کنید.
- به آرامی با مخلوط کردن حرارت دهید تا بجوشد و آگار حل شود.
- تا 5.0 میلی لیتر از آن را در لوله‌های آزمایشگاهی 16 میلی متری بریزید.
- لوله‌ها را در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی‌گراد تحت فشار 15 psi (1.03421 بار) به مدت 15 دقیقه قرار دهید.
- لوله‌ها را در حالت مایل (سطح زیاد، عمق کم) خنک کنید.
- لوله‌ها باید در یخچال نگه‌داری شوند تا از ماندگاری 6 تا 8 هفته آن‌ها اطمینان حاصل شود.
- محیط کشت تلقیح نشده به دلیل pH نمونه و برموتیمول بلو، سبز جنگلی تیره خواهد بود.
روش تست استفاده از سیترات
- با یک تلقیح سبک که از مرکز یک کلنی به خوبی ایزوله شده برداشته شده، سطح شیب‌دار را با حرکت به جلو و عقب رگه بزنید.
- لوله را به صورت هوازی در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد بین 4 تا 7 روز انکوبه کنید.
- تغییر رنگ سطح شیب دار را از سبز به آبی بررسی کنید.
تفسیر نتیجه تست استفاده از سیترات
واکنش مثبت: رشد ارگانیسم با تغییر رنگ از سبز به آبی تند در امتداد سطح شیب‌دار.
مثال: سالمونلا (Salmonella)، ادواردسیلا (Edwardsiella)، سیتروباکتر (Citrobacter)، کلبسیلا (Klebsiella)، انتروباکتر (Enterobacter)، سراتیا (Serratia)، پروویدنسیا (Providencia) و غیره.
واکنش منفی: بدون رشد ارگانیسم و بدون تغییر رنگ. سطح شیب‌دار سبز باقی می‌ماند.
مثال: اشریشیا (Escherichia)، شیگلا (Shigella)، مورگانلا (Morganella)، یرسینیا (Yersinia) و غیره.
کنترل کیفیت تست استفاده از سیترات
سیترات مثبت: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 (رشد ارگانیسم؛ رنگ آبی)
سیترات منفی: Escherichia coli ATCC 25922 (بدون رشد یا اثری از رشد ارگانیسم)
محدودیت‌های تست استفاده از سیترات
- برخی از ارگانیسم‌ها قادر به رشد در سیترات هستند و تغییر رنگی ایجاد نمی‌کنند. رشد ارگانیسم حتی در صورت عدم وجود تغییر رنگ، به عنوان یک تست استفاده از سیترات مثبت در نظر گرفته می‌شود.
- تست‌هایی که نتایج دوپهلو دارند باید تکرار شوند.
- واکنش‌های این محیط کشت به تنهایی برای شناسایی در سطح گونه کافی نیست.
مترجم: صادق حسینی‌کیا
