تکنیک ها
تست ایندول (Indole): اصول، شناساگر‌ها، روش، تفسیر نتایج و محدودیت‌ها
مقدمه تست ایندول
این تست توانایی باکتری‌های خاصی برای تجزیه اسید آمینه تریپتوفان (Tryptophane) به ایندول را نشان می‌دهد. تست تولید ایندول روش مهمی در شناسایی انتروباکتری‌ها (Enterobacteria) است. اکثر سویه‌های E. coli، P. vulgaris، P. rettgeri، M. morgani و گونه‌های Providencia با آزاد شدن ایندول، اسید آمینه تریپتوفان را تجزیه می‌کنند. این کار توسط زنجیره‌ای از تعدادی آنزیم درون‌سلولی (که عموماً به آن «تریپتوفاناز» (Tryptophanase) می‌گویند) انجام می‌شود. این روش (به عنوان بخشی از پروسه‌های تست IMViC)، برای افتراق بین اعضای خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) طراحی شده است.
در این تست، هنگام انجام آزمایش بر روی ارگانیسم‌های غیر‌تخمیر‌کننده و بی‌هوازی، از شناساگر Ehrlich (استفاده از اتیل الکل (Ethyl alcohol) به جای ایزوآمیل الکل (Isoamyl alcohol)، ابداع شده توسط Paul Ehrlich) استفاده می‌شود.
اصول تست ایندول
تریپتوفان یک اسید آمینه است که می‌تواند توسط باکتری‌هایی که آنزیم تریپتوفاناز تولید می‌کنند، آمین‌زدایی یا دآمیناسیون (Deamination) و هیدرولیز شود. ایندول با فرایند دآمیناسیون تریپتوفان، توسط مولکول واسطه ایندولپیروویک اسید (Indolepyruvic acid) تولید می‌شود. تریپتوفاناز واکنش دآمیناسیون را کاتالیز می‌کند که طی آن گروه آمین (-NH2) مولکول تریپتوفان حذف می‌شود. محصولات نهایی این واکنش عبارتند از: ایندول، اسید پیروویک (Pyruvic)، آمونیوم (NH4+) و انرژی. در این فرآیند پیریدوکسال فسفات (Pyridoxal phosphate) به عنوان کوآنزیم مورد نیاز است.
هنگامی که ایندول با شناساگر Kovac (که حاوی اسید هیدروکلریک و پارا-دی‌متیل‌آمینوبنزآلدهید (p-dimethylaminobenzaldehyde) در آمیل الکل است) ترکیب می‌شود، محلول از رنگ زرد به قرمز گیلاسی تغییر رنگ می‌دهد. از آنجا که آمیل الکل قابل حل در آب نیست، رنگ قرمز در یک لایه روغنی در بالای براث (Broth) ایجاد می‌شود.
در تست نقطه‌ای (Spot test)، ایندول (موجود در کاغذ صافی) در pH اسیدی با پارا-دی‌متیل‌آمینوسینام‌آلدهید (p-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA)) ترکیب می‌شود تا یک ترکیب رنگ آبی تا آبی-سبز تولید کند. محققان نشان داده‌اند که شناساگر نقطه‌ای ایندول (Spot Indole Reagent) در تشخیص تولید ایندول توسط اعضای خانواده انتروباکتریاسه و گونه‌های بی‌هوازی خاص مفید است.
شناساگر‌های مورد استفاده در تست ایندول
مواد لازم در هر لیتر:
| Indole Spot Reagent | |
| 10 گرم | پارا-دی‌متیل‌آمینوسینام‌آلدهید |
| 100 میلی‌لیتر | اسید هیدروکلریک 37 درصد |
| 900 میلی‌لیتر | آب دی یونیزه |
| Indole Kovacs Reagent | |
| 50 گرم | پارا-دی‌متیل‌آمینوبنزآلدهید |
| 250 میلی‌لیتر | اسید هیدروکلریک 37 درصد |
| 750 میلی‌لیتر | آمیل الکل |
روش تست ایندول
- یک لوله آزمایش استریل شده حاوی 4 میلی‌لیتر براث تریپتوفان بردارید.
- لوله را با یک کشت 18 تا 24 ساعته، به صورت آسپتیک (Aseptic) تلقیح کنید.
- لوله را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 28 ساعت انکوبه کنید.
- 5 میلی‌لیتر از شناساگر Kovac را به کشت براث اضافه کنید.
- وجود یا عدم وجود حلقه را بررسی کنید.
روش شناساگر نقطه‌ای ایندول (DMACA)
- چند قطره از شناساگر ایندول نقطه‌ای را روی یک تکه کاغذ صافی بریزید.
- با یک لوپ تلقیح یا اپلیکاتور چوبی، بخشی از کلنی ایزوله شده 18 تا 24 ساعته را از یک محیط غیرانتخابی برداشته و آن را روی ناحیه‌ای از کاغذ صافی که آغشته به شناساگر است، بمالید.
- فورا آن بررسی کنید.
تفسیر نتایج تست ایندول
مثبت: رنگ لایه شناساگر در بالای محیط در عرض چند ثانیه پس از افزودن معرف به رنگ صورتی تا قرمز (“حلقه قرمز گیلاسی”) درآید.
ارگانیسم‌هایی ایندول مثبت: Aeromonas hydrophila، Aeromonas punctata، Bacillus alvei، گونه‌های Edwardsiella، Escherichia coli، گونه‌های Flavobacterium، Haemophilus influenzae، Klebsiella oxytoca، گونه‌های Proteus (غیر از P. mirabilis و P. penneri) Plesiomonas shigelloides، Pasteurella multocida، Pasteurella pneumotropica، Enterococcus faecalis و گونه‌های Vibrio.
منفی: بدون تغییر رنگ حتی پس از افزودن شناساگر مناسب.
ارگانیسم‌هایی ایندول منفی: گونه‌های Actinobacillus، Aeromonas salmonicida، گونه‌های Alcaligenes، گونه‌های most Bacillus، گونه‌های Bordetella، گونه‌های Enterobacter، گونه‌های Lactobacillus، گونه‌های most Haemophilus، گونه‌های most Klebsiella، گونه‌هایNeisseria، Pasteurella haemolytica، Pasteurella ureae، Proteus mirabilis، P. penneri، گونه‌های Pseudomonas، گونه‌های Salmonella، گونه‌های Serratia، و گونه‌های Yersinia.
تفسیر نتایج شناساگر نقطه‌ای ایندول
واکنش مثبت: ایجاد رنگ آبی در عرض 3 دقیقه.
واکنش منفی: ایجاد رنگ صورتی در عرض 3 دقیقه.
تست ایندول نقطه‌ای
روش
- چند قطره از شناساگر پارا-دی‌متیل‌آمینوسینام‌آلدهید 1 درصد را روی یک تکه کاغذ صافی قرار بریزید تا اشباع شود.
- با یک لوپ تلقیح یا اپلیکاتور چوبی، بخشی از کلنی ایزوله شده 18 تا 24 ساعته را از یک محیط غیرانتخابی برداشته و آن را روی ناحیه‌ای از کاغذ صافی که آغشته به شناساگر است، بمالید.
- ایجاد رنگ را در بعد از 1 تا 3 دقیقه بررسی کنید.
نتایج مورد انتظار
- مثبت: یک واکنش مثبت با تغییر رنگ کاغذ صافی به رنگ آبی تا سبز-آبی بر روی اسمیر باکتری در عرض 2 تا 3 دقیقه مشخص می‌شود.
- منفی: کاغذ صافی در واکنش‌های منفی بی‌رنگ مانده یا رنگ صورتی روشن ایجاد می‌کنند.
نکته: واکنش مثبت در مورد باکتری Providencia alcalifaciens، ایجاد رنگ بنفش-قرمز است.
موارد استفاده از تست ایندول
- افتراق Proteus mirabilis (ایندول منفی) از سایر گونه‌های Proteus (ایندول مثبت).
- افتراق Klebssiella pneumoniae (ایندول منفی) از Klebsiella oxytoca (ایندول مثبت).
- افتراق Citrobacter freundii (ایندول منفی) از Citrobacter koseri (ایندول مثبت).
کنترل کیفیت برای تست ایندول
کنترل مثبت: Escherichia coli NCTC 10418
کنترل منفی: Proteus mirabilis NCTC 10975
محدودیت‌های تست ایندول
- آزمایشات ایندول ممکن است به عنوان یک روش کمکی در شناسایی و افتراق ارگانیسم‌های گرم مثبت و گرم منفی استفاده شود. آزمایشات بیوشیمیایی اضافی با استفاده از کشت‌های خالص برای شناسایی کامل توصیه می‌شود.
- تست با لوله آزمایش نسبت به تست نقطه‌ای روش حساس‌تری برای تشخیص ایندول است.
- هنگام انجام یک آزمایش نقطه‌ای، شناساگر ایندول Kovac ممکن است به عنوان جایگزینی برای شناساگر تست نقطه‌ای استفاده شود. با این حال هنگامی که از شناساگر ایندول Kovac به عنوان شناساگر تست نقطه‌ای استفاده می‌شود، در شناسایی ایندول نسبت به شناساگر ایندول نقطه‌ای (DMACA) حساسیت کمتری دارد.
- شناساگر ایندول Kovac برای شناسایی باکتری‌های بی‌هوازی توصیه نمی‌شود. ولی شناساگر نقطه‌ای ایندول (DMACA) برای شناسایی باکتری‌های بی‌هوازی مناسب می‌باشد.
- از آن‌جایی که همه پپتون‌ها (peptone) برای استفاده در آزمایش ایندول مناسب نیستند، محیط‌های انتخاب شده برای شناسایی ایندول باید با ارگانیسم‌های مثبت و منفی شناخته شده آزمایش شوند تا از مناسب بودن آن‌ها اطمینان حاصل شود.
- به دلیل تشکیل فرآورده‌های نهایی اسیدی که تولید ایندول را کاهش می‌دهند، نباید از محیط‌های حاوی گلوکز برای تست ایندول استفاده کرد. مولر هینتون آگار (Mueller Hinton Agar) نیز نباید برای این تست استفاده شود زیرا تریپتوفان در طی هیدرولیز اسیدی کازئین (Casein) از بین می‌رود.
- محیط‌های حاوی رنگ، مانند MacConkey و EMB، به دلیل انتقال احتمالی رنگ و ایجاد اشکال در تفسیر رنگ ایندول، منابع نامناسب برای تلقیح هستند.
- کلنی‌های ایندول مثبت باعث می‌شوند که کلنی‌های ایندول منفی مجاور به دلیل انتشار ایندول در محیط، مثبت کاذب به نظر برسند. برای جلوگیری از ایجاد نتیجه مثبت کاذب در آزمایش ایندول، کلنی‌هایی با مورفولوژی‌های (Morphology) متفاوت را انتخاب کنید که حداقل 5 میلی‌متر از یکدیگر فاصله دارند.
مترجم: فاطمه فریادرس
همچنین مطالب علمی بیشتری را بخوانید:
تست سولفید هیدروژن (Hydrogen Sulfide)
