تست بتالاکتاماز: اهداف، اصول، روش و نتایج

فهرست مطالب نمایش

هدف تست بتالاکتاماز

تست بتالاکتاماز برای شناسایی آنزیم بتالاکتاماز، که باعث مقاومت ارگانیسم‌های مختلف باکتریایی به پنی‌سیلین می‌شود، به کار می‌رود.

اصول تست بتالاکتاماز

باکتری‌های مختلف دسته‌ای از آنزیم‌ها به نام بتالاکتاماز تولید می‌کنند که ممکن است توسط ژن‌های روی پلاسمیدها (Plasmid) یا کروموزوم‌ها واسطه شوند. تولید بتالاکتاماز ممکن است با قرار گرفتن در معرض مواد ضد میکروبی ایجاد یا القا شود. بتالاکتامازها حلقه‌های بتالاکتام (Beta-lactam) انواع پنی‌سیلین‌ها و سفالوسپورین‌های (Cephalosporin) حساس را هیدرولیز (و در نتیجه غیر فعال) می‌کنند.

تست بتالاکتاماز به سرعت وجود آنزیم بتالاکتاماز تولید شده توسط سویه‌های استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus)، نایسریا گونوره (Neisseria gonorrhoeae)، برانهاملا کاتارالیس (Branhamella catarrhalis) و هموفیلوس آنفولانزا (Haemophilus influenzae) را شناسایی می‌کند. این آنزیم‌ها با شکستن حلقه بتالاکتام آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و سفالوسپورین، باعث ایجاد مقاومت نسبت به برخی از آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین شده و در نتیجه این داروها غیرفعال می‌شوند. این شیوه عمل اساس واکنش تست بتالاکتاماز را تشکیل می‌دهد.

تست‌های سریع بتالاکتاماز می‌توانند اطلاعات مرتبط بالینی را زودتر از تست MIC (Minimum Inhibitory Concentration) یا دیسک دیفیوژن (Disk diffusion test) ارائه دهند. چند تست بالینی برای شناسایی بتالاکتامازها ابداع شده است که این تست‌ها شامل روش یدومتری (Iodometric)، روش اسیدومتری (Acidometric) و سوبستراهای کروموژنیک (Chromogenic substrate) می‌باشند. روش‌های یدومتری برای تست نایسریا گونوره مناسب هستند.

روش‌های اسیدومتریک نتایج قابل قبولی را در تست شناسایی گونه‌های هموفیلوس، نایسریا گونوره و استافیلوکوک به دست می‌دهند. نیتروسفین (Nitrocefin) حساسیت زیادی به بتالاکتام‌های موجود دارد. دیسک‌های نیتروسف (Nitrocef) به نیتروسفین (یک سفالوسپورین (Cephalosporin) تولید کننده رنگ) آغشته می‌شوند. از آنجایی که پیوند آمیدی در یک حلقه بتالاکتام توسط یک بتالاکتاماز هیدرولیز می‌شود، رنگ نیتروسفین از زرد به قرمز تغییر می‌کند.

باکتری‌هایی که به مقدار قابل توجهی بتالاکتاماز تولید می‌کنند، این تغییر رنگ از زرد به قرمز را روی دیسک نیتروسف ایجاد می‌کنند. این بتالاکتامازها قادرند “پنی‌سیلین‌های حساس به پنی‌سیلیناز (Penicillinase)” مانند آموکسی‌سیلین (Amoxicillin)، آمپی‌سیلین (Ampicillin)، پنی‌سیلین، کاربنی‌سیلین (Carbenicillin)، مزلوسیلین (Mezlocillin) و پیپراسیلین (Piperacillin) را غیرفعال کنند.

روش تست بتالاکتاماز

با استفاده از یک دیسپنسر تک دیسکی، دیسک را از کارتریج درون یک ظرف پتری (Petri dish) خالی یا روی یک لام میکروسکوپ (Microscope slide) پخش کنید.

دیسک را با 1 قطره آب مقطر استریل مرطوب کنید.
با یک لوپ (Loop) و یا یک اپلیکاتور استریل شده، چند کلنی مشابه که به خوبی ایزوله شده‌اند را بردارید و روی سطح دیسک بمالید.
دیسک را برای مشاهده تغییر رنگ بررسی کنید.

واکنش مثبت: تغییر رنگ از زرد تا قرمز در ناحیه‌ای که کشت در آن اعمال می‌شود.

توجه: برای اکثر سویه‌های باکتریایی یک نتیجه مثبت در عرض 5 دقیقه حاصل می‌شود. با این حال، واکنش مثبت برای برخی استافیلوکوک‌ها ممکن است تا ۱ ساعت طول بکشد تا ایجاد شود و تغییر رنگ معمولاً در کل دیسک ایجاد نمی‌شود.

واکنش منفی: عدم تغییر رنگ روی دیسک

ارگانیسم‌ها	نتیجه	زمان تقریبی واکنش	تفسیر
استافیلوکوکوس اورئوس	مثبت	1 ساعت	مقاوم به پنی سیلین، آمپی‌سیلین، کاربنی‌سیلین. احتمالاً حساس به سفالوتین (Cephalothin)، متی‌سیلین (Methicillin)، اگزاسیلین (Oxacillin)، نافی‌سیلین (Naficillin) و سایر پنی‌سیلین‌های مقاوم به پنی‌سیلین.
انتروکوکوس فکالیس (Enterococcus faecalis)	مثبت	5 دقیقه	مقاوم نسبت به پنی‌سیلین و آمپی‌سیلین
هموفیلوس آنفولانزا	مثبت	1 دقیقه	مقاوم به آمپی‌سیلین، حساس به سفالوسپورین‌ها
نایسریا گونوره و برانهاملا کاتارالیس	مثبت	1 دقیقه	مقاوم به پنی‌سیلین

محدودیت‌های تست بتالاکتاماز

تشخیص بتالاکتاماز با دیسک نیتروسف نباید به طور کامل جایگزین روش‌های تست حساسیت مرسوم شود، زیرا عوامل دیگر نیز بر نتایج این آزمایش‌ها تأثیر می‌گذارند و در مواردی، مقاومت ذاتی به بتالاکتام با تولید بتالاکتاماز مرتبط نیست.
نوک سمپلر را بیش از حد اشباع نکنید زیرا ممکن است شناساگر را رقیق کند.
تشخیص فعالیت بتالاکتاماز در استافیلوکوک ممکن است تا یک ساعت طول بکشد. القای آنزیم نیز ممکن است مورد نیاز باشد، این کار را می‌توان با تست رشد در لبه یک دیسک اگزاسیلین انجام داد.
نتیجه منفی مقاومت ناشی از مکانیسم‌های دیگر را رد نمی‌کند.
روش دیسک نیتروسف را نمی‌توان برای آزمایش اعضای خانواده باکترهای انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae)، گونه‌های سودوموناس (Pseudomonas) یا سایر باسیل‌های هوازی گرم منفی استفاده کرد، زیرا نتایج ممکن است پیش‌بینی کننده حساسیت به بتالاکتام‌هایی که اغلب برای درمان استفاده می‌شوند، نباشد.
دیسک نیتروسف را نمی‌توان برای ارگانیسم‌هایی که مقاومت آن‌ها به پنی‌سیلین به دلیل تولید بتالاکتاماز نیست، استفاده کرد. مانند استرپتوکوک پنومونیه (Streptococcus pneumoniae) و استرپتوکوک ویریدانس (Viridans streptococci).