تست سولفید هیدروژن (Hydrogen Sulfide): اصول، روش، موارد استفاده و تفسیر

مقدمه‌ای بر تست سولفید هیدروژن

برخی از میکروارگانیسم‌ها توانایی تجزیه ترکیبات حاوی سولفور (گوگرد) به سولفید هیدروژن (H₂S) را در طی متابولیسم دارند که معمولاً به عنوان آزمایشی جهت شناسایی آن‌ها در آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شود.

روش‌های متعددی برای تشخیص تولید H₂S توسط میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود که با منبع سولفور و نمک‌های فلزی مورد استفاده برای نشان دادن تشکیل H₂S، متفاوت است. محیط کشت SIM به دلیل ماهیت نیمه جامد، عدم وجود کربوهیدرات‌های مزاحم و استفاده از آهن پپتونیزه شده (Peptonized iron) به عنوان اندیکاتور، در تشخیص H₂S از محیط کشت‌های TSI یا KIA حساس‌تر است. با این حال، کاغذ استات سرب (Lead acetate paper) 10 برابر حساس‌تر از سایر محیط‌های کشت است.

اهداف تست سولفید هیدروژن

برای تعیین این که آیا میکروب ترکیبات حاوی سولفور را به سولفید تجزیه می‌کند تا گاز سولفید هیدروژن تولید کند.

اصول

• یک ترکیب آهن و یک ترکیب سولفور به محیط آزمایش برای آزمایش تولید گاز سولفید هیدروژن اضافه می‌شود.
• اگر ترکیب سولفور توسط سویه باکتری تجزیه شود، سولفید هیدروژن تولید می‌شود. بنابراین این آزمایش تعیین می‌کند که آیا میکروب در طی فرآیند متابولیسم، ترکیبات حاوی سولفور را به سولفید تبدیل می‎کند یا خیر.
• H₂S توسط باکتری‌های خاصی از طریق تجزیه اسیدهای آمینه حاوی سولفور مانند سیستین (Cystine) و متیونین (Methionine) یا از طریق تجزیه ترکیبات سولفور غیرآلی مانند تیوسولفات‌ها (Thiosulfate)، سولفات‌ها (Sulfate) یا سولفیت‌ها (Sulfite) در طی تجزیه پروتئین یا زمانی که تنفس بی‌هوازی (Anaerobic respiration) الکترون‌ها را به جای اکسیژن به سولفور منتقل کند، تولید می‌شود.
• در هر صورت H₂S تولید می‌شود (گاز سولفید هیدروژن) و با ترکیب آهن واکنش داده و رسوب سیاه سولفید آهن را ایجاد می‌کند.
• رنگ سیاه به عنوان یک شاخص در مورد وجود سولفید هیدروژن عمل می‌کند. یافتن گاز سولفید هیدروژن تولید شده توسط یک ارگانیسم، عمدتاً برای کمک به شناسایی آن ارگانیسم خاص استفاده می‌شود.

محیط کشت مورد استفاده در تست سولفید هیدروژن

این آزمایش را می‌توان با استفاده از چندین محیط کشت از جمله تریپل شوگر آیرون (Triple Sugar Iron (TSI))، کلیگر آیرون آگار (Kligler’s Iron Agar (KIA))، محیط کشت SIM و کاغذ استات سرب انجام داد.

• محیط کشت سولفیت ایندول موتیلیتی (Sulphite indole motility (SIM)) برای تشخیص H₂S

این محیط حاوی سولفات آمونیوم آهن و تیوسولفات سدیم است که با هم به عنوان شاخصی برای تولید سولفید هیدروژن عمل می‌کنند. زمانی تولید سولفید هیدروژن قابل تشخیص است که سولفید آهن (به شکل یک رسوب سیاه رنگ) به دلیل واکنش سولفات آمونیوم آهن با گاز H₂S ، تولید شود.

ترکیبات

عصاره گوشت گاو 3 گرم، پپتون (Peptone ) 30 گرم، سولفات آمونیوم آهن 0.2 گرم، تیوسولفات سدیم 0.025 گرم، آگار 3 گرم، pH نهایی (در دمای 25 درجه سانتی گراد) 0.2±7.3، آب مقطر 1000 میلی‌لیتر.

• محیط‌های کشت آیرون آگار (Iron agar) در تشخیص H₂S

این محیط برای تشخیص تولید H₂S توسط انتروباکتریا (enterobacteria) مناسب است. در این‌جا H₂S توسط سیترات آهن موجود در محیط شناسایی می‎شود

• تست کاغذ استات سرب برای تشخیص H₂S

هنگامی که یک تکنیک حساس در تشخیص تولید H₂S مورد نیاز است، تست کاغذ استات سرب توصیه می‌شود.

روش تست سولفید هیدروژن

I. در محیط کشت سولفیت ایندول موتیلیتی

1. ارگانیسم را با سوزن تلقیح در یک لوله برچسب‌دار تلقیح کنید.
2. لوله‌های تلقیح شده را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه کنید.
3. تشکیل رسوب سیاه در محیط را بررسی کنید.

II. در محیط کشت کلیگر آیرون آگار و تریپل شوگر آیرون آگار

1. ارگانیسم مورد آزمایش را در محیط کشت کلیگر آیرون آگار تلقیح کرده و در دمای مناسب در طول شب انکوبه کنید.
2. سیاه شدن محیط کشت را بررسی کنید.

III. تست کاغذ استات سرب

1. یک لوله یا بطری آب پپتون استریل یا نوترینت براث (Nutrient broth) را با ارگانیسم مورد آزمایش تلقیح کنید.
2. یک نوار کاغذ استات سرب را در قسمت باریک بطری یا لوله بالای محیط قرار دهید و درب آن را ببندید.
3. محیط تلقیح شده را در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه کرده و آن را روزانه از نظر سیاه شدن قسمت پایین نوار بررسی کنید.

نتایج

• نتیجه مثبت: سیاه شدن محیط
• نتیجه منفی: بدون سیاه شدن محیط

موارد استفاده از تست سولفید هیدروژن

• این تست عمدتاً برای کمک به شناسایی اعضای خانواده انتروباکتریاسه و گاهی اوقات برای افتراق باکتری‌های دیگر مانند گونه‌های باکتروئیدس (Bacteroides) و بروسلا (Brucella) استفاده می‌شود.
• این تست به شناسایی و افتراق اعضای خانواده باکتری‌های انتروباکتریاسه (انتریک‌ها) از سایر گرم-باسیل‌ها کمک می‌کند.
• این تست به ویژه در شناسایی گونه‌های سالمونلا (Salmonella)، فرانسیسلا (Francisella) و پروتئوس (Proteus) مفید است.

محدودیت‌های تست سولفید هیدروژن

• تولید H₂S ممکن است در محیط کشت TSI برای ارگانیسم‌هایی که از ساکارز (که مکانیسم آنزیمی را که منجر به تولید H₂S می‌شود را سرکوب می‌کند) استفاده می‌کنند، مهار شود.
• استات سرب برای باکتری‌ها سمی است و ممکن است از رشد برخی باکتری‌ها جلوگیری کند. اجازه ندهید محیط کشت با نوار تماس پیدا کند.
• توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک (Immunologic)، مولکولی یا طیف سنجی جرمی (Mass spectrometry) روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:

دوره مهارت آموزی میکروبیولوژی

تست متیل رد (Methyl Red): قواعد، روش و تفسیر نتایج

منبع

مترجم: فاطمه فریادرس