تست فاکتور X و V: اصول، روش استفاده، کاربرد و تفسیر

فهرست مطالب نمایش

مقدمه تست فاکتور X و V

باکتری‌های گونه هموفیلوس (Haemophilus) باسیل‌های کوچک، پلئومورفیک (Pleomorphic)، گرم منفی یا کوکوباسیل‌هایی (Coccobacilli) با آرایش تصادفی هستند.
یک گونه مهم بالینی از این جنس، آنفلوانزا بوده که یک ارگانیسم سخت‌پسند (Fastidious) است و در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد با تقریباً 5 درصد CO₂ در حضور فاکتورهای رشد کمکی خاصی به نام فاکتورهای X و V بهترین رشد را دارد.
فاکتور X شامل پروتوپورفیرین (Protoporphyrin) IX است که هِمین (Haemin) یا سایر پورفیرین‌های (Porphyrin) حاوی آهن نیز نامیده می‌شود. این فاکتورها برای رشد مورد نیاز هستند زیرا سویه‌های وابسته به فاکتور X قادر به تبدیل d-aminolaevulinic acid به پروتوپورفیرین نیستند. آن‌ها همچنین در برابر حرارت پایدار هستند.
فاکتور V شامل نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید (nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)) یا نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید فسفات (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP)) می‌باشد. این فاکتورها نسبت به حرارت حساس هستند.
با این حال، گونه‌های مختلف هموفیلوس (Haemophilus) نیازهای متفاوتی به فاکتورهای رشد X و V دارند.
مثلا هموفیلوس پاراآنفلوآنزا (Parainfluenzae) برای رشد فقط به فاکتور V نیاز دارد در حالی که هموفیلوس دوکرئی (Haemophilus ducreyi) فقط به فاکتور X نیاز دارد.

هدف تست فاکتور X و V

افتراق بین گونه‌های هموفیلوس بر اساس نوع استفاده آن‌ها از فاکتورهای رشد X و V.

اصول تست فاکتور X و V

اعضای گونه هموفیلوس به فاکتورهای رشد کمکی در شرایط آزمایشگاهی نیاز دارند. تعدادی از گونه‌های هموفیلوس تنها به فاکتور X (هِمین) یا تنها به فاکتور V (نیکوتین آدنین دینوکلئوتید) یا ترکیبی از این دو نیاز دارند. در نتیجه این تفاوت معنی‌دار در نیاز به فاکتورهای رشد در گونه‌های هموفیلوس، امکان افتراق آن‌ها را فراهم می‌کند.

در آزمایشگاه، لایه‌ای از ارگانیسم مورد آزمایش را روی محیط‌های کشت Heart infusion agar، Tryptic soy agar ، Haemophilus agar یا Nutrient agar قرار می‌دهیم. دیسک‌ها یا نوارهای آغشته شده (به فاکتورهای X، V یا XV) را مستقیماً روی آن قرار داده و اجازه می‌دهیم فاکتور رشد کمکی در محیط کشت انتشار یابد. ارگانیسم‌ها فقط در اطراف قرصی رشد می‌کنند که فاکتور مناسب برای رشد آن‌ها را فراهم می‌کند.

رشد ارگانیسم در اطراف قرص و نه در جای دیگر روی پلیت نشان دهنده نیاز به آن فاکتور خاص است. از این رو افتراق ارگانیسم‌ها بر اساس وجود یا عدم وجود رشد در اطراف و یا بین قرص‌های اشباع شده با فاکتورهای X، V و XV صورت می‌پذیرد.

دیسک‌های آزمایش

دیسک‌های فاکتور X و V، دیسک‌های کاغذی هستند که به فاکتورهای رشد آغشته شده‌اند. هر قرص فاکتور X به هِمین و هر قرص فاکتور V به نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید آغشته شده است. همچنین هر قرص فاکتور XV به ترکیبی از هِمین و NAD آغشته شده است.

روش تست فاکتور X و V

با استفاده از تکنیک آسپتیک (Aseptic)، کلنی‌های جدا شده از کلنی‌های مشکوک را انتخاب کنید و سوسپانسیونی معادل استاندارد 0.5 مکفارلند تهیه کنید.
یک سواب استریل را در سوسپانسیون ارگانیسم فرو کنید. سواب را روی تمام سطح پلیت تریپتیکاز سوی آگار (Trypticase soy agar) بغلتانید. تلقیح را با کشت خطی (Streaking) در سه جهت مختلف با چرخاندن پلیت به میزان 60 درجه بعد از هر بار انجام آن، انجام دهید. استریکینگ به این روش رشد یکنواخت را تضمین می‌کند.
اجازه دهید سطح آن برای خشک شدن، 3 تا 5 دقیقه بماند.
قرص‌های فاکتور X، V و XV را روی سطح آگار قرار دهید. اگر از قرص‌های جداگانه استفاده می‌کنید، آن‌ها را حداقل 4 تا 5 سانتی‌متر از هم فاصله دهید.
آگار را برای یک شب در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
رشد یا عدم رشد ارگانیسم را در اطراف دیسک‌ها بررسی کنید.

نتایج مورد انتظار

مثبت:

رشد ارگانیسم در اطراف دیسک XV، نیاز به هر دو فاکتور را نشان می‌دهد.
رشد ارگانیسم در اطراف دیسک V، عدم رشد آن در اطراف دیسک X، و رشد کم آن در اطراف دیسک XV، نیاز به فاکتور V را نشان می‌دهد.
رشد ارگانیسم در اطراف دیسک X، عدم رشد آن در اطراف دیسک V، و رشد کم آن در اطراف دیسک XV، نیاز به فاکتور X را نشان می‌دهد.

منفی:

رشد در کل سطح آگار نشان دهنده عدم نیاز به فاکتور X یا V است.

کاربردهای تست فاکتور X و V

فاکتورهای X و V برای افتراق گونه‌های هموفیلوس از جمله Aggregatibacter aphrophilus بر اساس نیاز آن‌ها به فاکتورهای رشد استفاده می‌شوند.

محدودیت‌های تست فاکتور X و V

توصیه میشود جهت شناسایی کامل، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک (immunological)، مولکولی یا طیفسنجی جرمی (Mass spectrometry) روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
از آن‌جایی که شباهت‌هایی در نیاز به فاکتورهای رشد بین گونه‌های هموفیلوس وجود دارد، توصیه نمی‌شود که این روش تنها معیار برای شناسایی گونه باشد.
در هنگام تلقیح نمونه‌ها روی محیط‌های کشت باید مراقب بود تا از انتقال مواد مغذی جلوگیری شود.