تست لیتموس میلک: اصول، روش و تفسیر نتایج

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تست لیتموس میلک

لیتموس میلک یک محیط کشت مبتنی بر شیر است که از شیر بدون چربی و نشانگر pH آزولیتمین (Azolitmin (لیتموس)) تشکیل شده است. آزولیتمین در pH برابر 4.5 صورتی و در pH برابر 8.3 آبی رنگ است. بین این بازه، آزولیتمین بنفش رنگ است. لیتلموس علاوه بر اینکه یک نشانگر pH است، یک شاخص Eh (اکسیداسیون-کاهش) نیز می‌باشد. لیتموس کاهش یافته سفید و لیتموس اکسید شده بنفش رنگ است.

محیط لیتموس میلک میکروارگانیسم‌ها را بر اساس توانایی آن‌ها در متابولیزه کردن لیتموس میلک افتراق می‌کند. چهار واکنش اصلی در لیتموس میلک عبارتند از:

تخمیر لاکتوز (Lactose)
کاهش لیتموس
انعقاد کازئین (Casein)
هیدرولیز کازئین

ترکیب این واکنش‌ها نتایج متفاوتی را به همراه دارد که از هر کدام می‌توان برای افتراق باکتری‌ها استفاده کرد.

تست لیتموس میلک — A: واکنش اسیدی، B: واکنش قلیایی، C: بدون تغییر، D: کاهش لیتموس، E، لخته (به جدا شدن مایع شفاف از لخته در قسمت فلش توجه کنید)، F: پپتونیزاسیون (Peptonization).

لیتموس میلک عمدتاً برای افتراق اعضای جنس کلستریدیوم (Clostridium) استفاده می‌شود و همچنین انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) را از سایر باسیل‌های گرم منفی افتراق می‌کند. لیتموس میلک همچنین کار کشت و نگه‌داری از باکتری‌های اسید لاکتیک (Lactic acid) را انجام می‌دهد.

اصول

تست لیتموس میلک توانایی ارگانیسم را برای متابولیزه کردن لیتموس میلک بررسی می‌کند. چهار واکنش اصلی در لیتموس میلک رخ می‌دهد: تخمیر لاکتوز، کاهش لیتموس، انعقاد کازئین و هیدرولیز کازئین.

تخمیر لاکتوز: تخمیر لاکتوز زمانی نشان داده می‌شود که لیتموس در نتیجه تولید اسید صورتی رنگ شود. اگر اسید کافی تولید شود، کازئین در شیر رسوب کرده و یک لخته اسیدی تشکیل می‌دهد. لخته‌های اسیدی محیط را جامد می‌کنند و بسته به وضعیت اکسیداسیون-کاهش لیتموس، می‌توانند صورتی یا سفید با یک نوار صورتی در بالای محیط ظاهر شوند. لخته‌های اسیدی را می‌توان در شرایط قلیایی حل کرد. شکاف‌ها یا ترک‌ها در لخته، شواهدی از تولید گاز هستند. به تولید گاز سنگین که لخته را می‌شکند، تخمیر طوفانی (Stormy fermentation) می‌گویند. تخمیر طوفانی لیتموس میلک از ویژگی‌های کلستریدیوم پرفرنجنس (Clostridium perfringens) می‌باشد.
کاهش لیتموس: برخی از میکروارگانیسم‌ها لیتموس را کاهش می‌دهند. اگر لیتموس در طی فرایند تخمیر لاکتوز کاهش یابد، محیط را در قسمت پایین لوله سفید می‌کند، یعنی جایی که سرعت کاهش بیشتر است.
انعقاد کازئین: برخی از باکتری‌ها آنزیم‌های پروتئولیتیک (Proteolytic) (کی‌سیزها (Casease)) مانند رنین (Rennin)، پپسین (Pepsin) یا کیموتریپسین (Chymotrypsin) تولید می‌کنند که باعث انعقاد کازئین شده و دَلَمه ایجاد می‌کنند. دلمه با لخته اسیدی متفاوت است زیرا در شرایط قلیایی حل نمی‌شود. در مورد برخی از ارگانیسم‌ها، دلمه منقبض می‌شود و مایعی به رنگ زرد کم رنگ به نام آب پنیر (Whey) در سطح ایجاد می‌کند.
هیدرولیز کازئین: برخی از باکتری‌ها کی‌سیزها را تولید می‌کنند که کازئین را هیدرولیز می‌کند و باعث می‌شود شیر به رنگ زرد کم رنگ و شبیه سرم کدر شود. باکتری‌هایی که فقط می‌توانند تا حدی کازئین را هضم کنند، آمونیاک (NH3) تولید می‌کنند که pH محیط را افزایش می‌دهد و لیتموس را آبی می‌کند. تشکیل یک حلقه آبی یا بنفش در بالای مایع شفاف یا آبی شدن کل محیط نشان دهنده یک واکنش قلیایی است.

محیط کشت

شیر بدون چربی مواد مغذی برای رشد، لاکتوز را برای تخمیر و پروتئین را به شکل کازئین فراهم می‌کند.

مواد تشکیل دهنده	مقدار (گرم/لیتر)
پودر شیر بدون چربی	100 گرم
لیتموس	0.5 گرم
سولفیت سدیم (Sodium sulfite)	0.5 گرم
pH محیط: 6.8

کنترل کیفیت

تخمیر: کلستریدیوم پرفرنجنس (ATCC13124): تولید گاز
اسید: لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (ATCC11506) (Lactobacillus acidophilus): تشکیل لخته
پپتونیزاسیون: سودوموناس آئروژینوزا (ATCC27853) (Pseudomonas aeruginosa): شفاف‌سازی

روش

یک محیط لیتموس میلک را با چهار قطره کشت براث (Broth) 24 ساعته تلقیح کنید.
آن را در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد در هوای محیط انکوبه کنید.
روزانه به مدت هفت روز محیط را بررسی و همه تغییرات را ثبت کنید.
محیط را از نظر بروز واکنش قلیایی (لیموس آبی می‌شود)، واکنش اسیدی (لیتلموس صورتی می‌شود)، کاهش لیتلموس، لخته اسیدی، لخته مایه پنیر و پپتونیزاسیون برررسی کنید. تغییرات متعددی می‌تواند در طول دوره مشاهده رخ دهد.

نتایج و تفسیرهای تست لیتموس میلک

شکل ظاهری شاخص لیتلموس

رنگ	تفسیر	ارگانیسم
رنگ صورتی یا ارغوانی	واکنش اسیدی (A)	اشرشیاکلی (Escherichia coli)
محیط آبی رنگ یا نوا ر آبی رنگ در بالای محیط	واکنش قلیایی (K)	آلکالیژنس فکالیس (Alcaligenes faecalis) / سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa)
بنفش (رنگ یکسان با محیط کنترل تلقیح نشده)	بدون تغییر (No change (NC))
رنگ سفید (در بخش پایینی محیط)	کاهش لیتلموس (R). به عنوان رنگ‌زدا شده، ثبت می‌شود

محیط لیتموس میلک — (از چپ به راست: واکنش قلیایی، کنترل بدون تلقیح، واکنش قلیایی (K)، هضم پپتون (D)، تولید اسید و گاز (G)، اسید (A) و لخته‌های اسیدی (AC). مایع شفاف روی سطح لوله‌های D و G یک روغن معدنی است که برای بی‌هوازی کردن محیط استفاده می‌شود.)

شکل ظاهری شیر

قوام شیر	تفسیر	ارگانیسم
انعقاد یا لخته شدن	تشکیل لخته
نیمه جامد و نه صورتی رنگ؛ وجود مایع شفاف تا خاکستری در بالای محیط	دلمه بستن (C)
صورتی و جامد (در صورت کاهش لیتموس، رنگ سفید در قسمت پایینی محیط)؛ لخته متحرک نیست	لخته اسیدی (AC)	لاکتوباسیلوس لاکتیس (Lactobacillus lactis)
شکاف در لخته	گاز (G)	کلستریدیوم استوبوتیلیکوم (Clostridium acetobutylicum)
لخته از هم جدا شده	تخمیر طوفانی (S)
حل شدن لخته و وجود مایع شفاف، مایل به خاکستری، آبکی و یک لخته صورتی جمع شده و نامحلول.	هضم پپتون (D) (واکنش اسیدی)	کلستریدیوم اسپوروژنز
حل شدن لخته و وجود مایع مایل به خاکستری و آبکی و یک لخته آبی شفاف، جمع شده و نامحلول	پپتونیزاسیون^* (P) (واکنش قلیایی)