مقدمه تست لیپاز

لیپید (Lipid) یک اصطلاح کلی است که برای توصیف انواع چربی‌‎ها استفاده می‌‎شود. چربی‌ها از پیوند استری (Ester linkage) بین سه مولکول از اسیدهای چرب (Fatty acid) و یک مولکول گلیسرول (Glycerol) تشکیل می‌شوند. چربی‌های ساده به عنوان تری‎گلیسیرید (Triglyceride) یا تری‌‎گلیسرول (triacylglycerol) شناخته می‌شوند.

تری‎گلیسیریدها از گلیسرول و سه اسید چرب با زنجیره بلند تشکیل شده‌اند. آنزیم‌هایی که چربی ساده را به ترکیباتش یعنی اسید چرب و گلیسرول تجزیه می‌کنند، لیپاز نامیده می‌شوند.

برخی از میکروارگانیسم‌ها دارای آنزیم لیپاز هستند. بنابراین می‎توان آن‎ها را بر اساس توانایی‌شان در تولید و ترشح لیپازها طبقه‌بندی کرد. بسته به نوع ارگانیسم مورد آزمایش، می‌توان از انواع چربی‌های ساده برای این طبقه‌بندی استفاده کرد.

اهداف

• برای تعیین توانایی میکروارگانیسم‌ها در تولید آنزیم لیپاز.
• شناسایی باکتری بر اساس عمل لیپاز آن.

اصول

Egg Yolk Agar یک محیط کشت افتراقی و غنی شده است که در جداسازی و تفکیک فرضی گونه‌های مختلف بر اساس توانایی تولید لیپاز در میان سایر گونه‌ها، استفاده می‌شود.

محیط کشت غیر انتخابی همراه با سوسپانسیون زرده تخم مرغ، لسیتین (Lecithin) و چربی‌های آزاد که بسترهای مورد نیاز برای تشخیص تولید لسیتیناز (Lecithinase) و لیپاز و عمل پروتئولیتیک (Proteolytic) هستند، را فراهم می‎کند.

میکروارگانیسم‌هایی که دارای آنزیم لیپاز هستند، چربی‌های آزاد موجود در محیط کشت را هیدرولیز می‎کنند تا گلیسرول و اسیدهای چرب آزاد تشکیل شود. در نتیجه، آزاد شدن اسیدهای چرب آزاد غیر قابل حل، منجر به تشکیل یک جلای رنگین‌کمانی (روغن روی آب) می‎شود که وقتی پلیت (Plate) در زاویه‌ای مناسب نسبت به منبع نور قرار می‎گیرد، دیده می‌شود. از آنجایی که لیپاز چندان قابل انتشار نیست، فقط روی سطح آگار و در مجاورت کلنی واکنش ایجاد می‌کند.

محیط کشت:

Egg Yolk Agar

ترکیبات

پانکراتیک دایجست کازئین (Pancreatic Digest of Casein) 15 گرم، ویتامین K1 برابر 10 گرم، کلرید سدیم 5 گرم، پاپیک دایجست (Papaic Digest) کنجاله سویا (Soybean Meal) 5 گرم، عصاره مخمر 5 گرم، L-Cystine برابر 0.4 گرم، Hemin برابر 5 گرم، امولسیون زرده تخم مرغ 100 میلی‌لیتر، آگار 20 گرم.

pH نهایی: 0.3±7.0 در دمای 25 درجه سانتی‎گراد.

روش انجام تست لیپاز

• با یک لوپ آزمایشگاهی(Loop) ارگانیسم آزمایشی را بردارید و آن را به صورت یک خط مستقیم روی پلیت (Plate) بکشید.
• محیط کشت را بلافاصله پس از کشیدن لوپ روی پلیت در گاز پک جار (Gas pak jar) به صورت بی‎‌هوازی انکوبه کنید و به انکوباتور در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 48 ساعت برای ارگانیسم‌های بی‌هوازی منتقل کنید. برای ارگانیسم‌های هوازی پلیت را در دمای 37 تا 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 تا 48 ساعت انکوبه کنید.
• پلیت را از نظر ایجاد یک درخشش رنگین‌کمانی بررسی کنید.

نتایج

• تست مثبت: تست لیپاز مثبت با ظاهر شدن یک جلای رنگین کمانی (که وقتی پلیت در زاویه مناسب نسبت به منبع نور قرار می‌گیرد، قابل مشاهده است) بلافاصله در اطراف کلونی‌ها مشخص می‌شود.
• تست منفی: تست لیپاز منفی با عدم وجود درخشندگی رنگین کمانی نشان داده می‌شود.

موارد استفاده از تست لیپاز

• تست لیپاز برای شناسایی و شمارش باکتری‌های لیپولیتیک (Lipolytic) به ویژه در محصولات لبنی پرچرب استفاده می‌شود.
• انواع دیگر بسترهای لیپیدی، از جمله روغن ذرت، روغن زیتون و روغن سویا، برای تشخیص ویژگی‌های افتراقی در بین اعضای باکتر‎های خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae)، کلستریدیوم (Clostridium)، استافیلوکوکوس (Staphylococcus) و نایسریا (Neisseria) استفاده می‌شوند.
• در چندین گونه قارچی نیز توانایی لیپولیتیک دیده شده است.

محدودیت‌های تست لیپاز

• توصیه می‌شود برای شناسایی کامل، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک (immunologic)، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی (mass spectrometry) روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
• برخی از میکروارگانیسم‌ها ممکن است تا یک هفته زمان نیاز داشته باشند تا واکنش لیپاز مثبت ایجاد کنند.

منبع

مترجم: فاطمه فریادرس

همچنین مطلب علمی بیشتری را بخوانید:

تست لسیتیناز (Lecithinase)