تست مصرف سریع کربوهیدرات (RCUT) برای نایسریا (Neisseria)

تست مصرف سریع کربوهیدرات (RCUT) چیست؟

به طور سنتی، سیستین تریپتیکاز آگار (cystine trypticase agar (CTA)) همراه با یک محلول کربوهیدرات 1٪ برای تعیین تولید اسید توسط نایسریا و گونه‌های مرتبط استفاده می‌شد. این تست اکنون دیگر توصیه نمی‌شود و با تست مصرف سریع کربوهیدرات (RCUT) جایگزین شده است. در تست مصرف سریع کربوهیدرات، الگوهای تولید اسید از کربوهیدرات‌ها (گلوکز، مالتوز، لاکتوز، ساکارز و فروکتوز) برای شناسایی نایسریا و گونه‌های مرتبط استفاده می‌شود. تولید اسید از کربوهیدرات‌ها با تغییر رنگ نشانگر فنول رد (Phenol red) از قرمز به زرد نشان داده می‌شود.

اصول

مقادیر کوچک (0.1 میلی‌لیتر) محلول PBS (Phosphate-buffered saline solution) حاوی فنول رد به عنوان نشانگر pH در یک سری لوله توزیع می‌شود. این لوله‌ها با نام‌های گلوکز، مالتوز، ساکارز و لاکتوز برچسب گذاری می‌شوند.

یک قطره از کربوهیدرات‌های منفرد (20% وزنی حجمی (w/v)) به لوله‌ها مطابق با برچسب آن‌ها اضافه می‌شود. یعنی 20% وزنی حجمی از گلوکز در لوله‌ای که با عنوان گلوکز برچسب گذاری شده است، اضافه می‌شود.

یک سوسپانسیون سنگین ایزوله آزمایشی در بافر بدون کربوهیدرات تهیه می‌شود. یک قطره از این سوسپانسیون به هر یک از لوله‌های برچسب گذاری شده، اضافه می‌شود.

گونه‌های نایسریا از منبع کربوهیدرات موجود در لوله‌ها استفاده می‌کنند و اسید را از طریق یک مسیر اکسیداتیو (Oxidative pathway) تولید می‌کنند (بر خلاف سایر ارگانیسم‌ها که از طریق مسیر تخمیر (Fermentative pathway) اسید تولید می‌کنند). اسیدی که در نتیجه فرایند مذکور تولید می‌شود، زمانی که از ظرفیت بافری محلول فراتر رود، باعث می‌شود که رنگ محیط از قرمز (قلیایی) به زرد (اسیدی) تغییر کند.

تست مصرف سریع کربوهیدرات همچنین برای شناسایی آگرگاتی‌باکتر آفروفیلوس (Aggregatibacter aphrophilus) (که قبلاً هموفیلوس آفروفیلوس (Haemophilus aphrophilus) ، یکی از ارگانیسم‌های HACEK، نامیده می‌شد)، اکتینوباسیلوس اکتینومایستم‌کومیتانس (A. actinomycetemcomitans) و گاردنرلا واژینالیس (Gardnerella vaginalis) انجام می‌شود.

محیط و شناساگرها

الف. محلول نمک متعادل فسفات (Phosphate Balanced Salt Solution (BSS)) (محلول استوک ×10 با فرمول زیر)

• دی پتاسیم فسفات (Dipotassium phosphate (K₂HPO₄)): 0.4 گرم
• مونوپتاسیم فسفات (Monopotassium phosphate (KH₂PO₄)): 0.1 گرم
• کلرید پتاسیم (Potassium chloride (KCl)): 0 گرم
• آب مقطر: 100 میلی‌لیتر

با فیلتر آن را استریل کنید و در دمای 4 تا 8 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری کنید.

ب. محلول working

10 میلی‌لیتر از 10× BSS را به 90 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید. پس از آن، 0.5 تا 0.8 میلی‌لیتر از محلول آبی 1٪ فنول رد را به محلول اضافه کنید، به طوری که محصول نهایی به رنگ “قرمز گیلاسی” درآید. سپس این محلول کار را با فیلتر استریل نمایید.

برای اطمینان از اینکه آب مقطر دارای PH مناسب است، استفاده از آب مقطر استریل با گرید دارویی توصیه می‌شود.

ج. محلول‌های کربوهیدرات استوک

10 گرم گلوکز، مالتوز، ساکارز و لاکتوز، هر کدام را جداگانه وزن کنید. هر یک را در 50 میلی‌لیتر آب مقطر حل کنید. محلول‌ها را با فیلتر استریل نموده، در ویال‌های استریل توزیع و در دمای منفی 20 درجه سانتی‌گراد منجمد کنید.

مهم است که از کربوهیدرات‌های ” گرید ریجنت” (Reagent-grade) استفاده شود، زیرا مالتوز برخی از فروشندگان محیط‌های باکتریولوژیک ممکن است به گلوکز آلوده باشد.

نمونه: کشت خالص (18 ساعته تا 24 ساعته) دیپلوکوک‌های (Diplococci) گرم منفی، اکسیداز مثبت (Oxidase-positive) و کاتالاز مثبت (Catalase-positive) رشد کرده روی محیط غیرانتخابی (شکلات آگار (Chocolate agar) یا معادل آن).

روش در تست مصرف سریع کربوهیدرات یا RCUT

آماده‌سازی لوله کربوهیدرات

1. یک سری از لوله‌های استریل 75 × 12 میلی‌متری را با کربوهیدرات مورد آزمایش (مانند گلوکز، مالتوز، ساکارز و لاکتوز) برچسب بزنید و 0.10 میلی‌لیتر BSS کار را در هر لوله اضافه کنید.
2. یک قطره از هر یک از کربوهیدرات‌ها را با پیپت پاستور (Pasteur pipette) به لوله‌ای که دارای برچسب مناسب است، اضافه کنید.

آماده‌سازی تلقیح

1. یک لوله استریل برداشته و آن را با شماره ایزوله یا نمونه برچسب بزنید.
2. 3 تا 0.4 میلی‌لیتر BSS در آن بریزید.
3. چند کلنی ایزوله شده از ارگانیسم مورد آزمایش (کشت 18-24 ساعته از شکلات آگار) را با یک لوپ (Loop) باکتریولوژیک استریل به لوله منتقل کنید.
4. لوله را با دقت در ورتکس (Vortex) مخلوط کنید تا یک سوسپانسیون یکنواخت و سنگین به دست آید.

مخلوط کردن و انکوباسیون

1. یک قطره از سوسپانسیون تلقیح را به هر یک از لوله‌های حاوی کربوهیدرات اضافه کنید.
2. برای اطمینان از مخلوط شدن کامل، لوله‌ها را برای مدت کوتاهی تکان دهید.
3. لوله‌ها را به مدت 4 ساعت در انکوباتور هوازی یا بن‌ماری (Water bath) با دمای 35 درجه سانتی‌گراد قرار دهید.

توجه: لوله‌های کربوهیدرات نباید در انکوباتور با هوای حاوی دی‌اکسید کربن انکوبه شوند. دی اکسید کربن ممکن است در محیط کشت پخش شود و اسید کربنیک تشکیل دهد که ممکن است باعث بروز واکنش اسیدی مثبت کاذب شود.

نتایج و تفسیرهای تست مصرف سریع کربوهیدرات یا RCUT

ایجاد رنگ زرد در هر یک از لوله‌های حاوی کربوهیدرات، نشان دهنده استفاده از آن کربوهیدرات توسط ارگانیسم است. در تست‌های منفی مصرف کربوهیدرات، لوله‌ها قرمز یا قرمز نارنجی باقی می‌مانند.

الگوهای تولید اسید گونه‌های نایسریا و موراکسلا کاتارالیس (M. catarrhalis)

کاربردهای تجاری

کیت CarboFerm Neisseria از شرکت Hardy Diagnostics یک روش سریع برای شناسایی ایزوله‌های نایسریا گونوره، نایسریا مننژیتیدیس، نایسریا سیکا (N.sicca)، نایسریا لاکتامیکا و موراکسلا کاتارالیس می‌باشد. کیت CarboFerm Neisseria از یک کووت شناساگر 8 چاهکی (8-well reagent cuvette) تشکیل شده است که به صورت 12 نوار در یک قاب پلاستیکی بسته‌بندی شده است. بر اساس اصول تست مصرف سریع کربوهیدرات، این کیت در عرض 4 ساعت نتیجه را ارائه می‌دهد.

همچنین بخوانید:

• تست اوره آز
• تخمیر اکسیداتیو Oxidative fermentative OF
• فسفات بافر سالین PBS
• فنول رد چیست؟

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا