مقدمهای بر تست هیدرولیز ژلاتین (Gelatin Hydrolysis Test)
ژلاتین پروتئینی است که از بافت همبند (Connective tissue) مهرهداران یعنی کلاژن به دست میآید. هنگامی که کلاژن در آب جوشانده شود، ژلاتین تولید میشود. تست هیدرولیز ژلاتین جهت شناسایی وجود ژلاتینازها (Gelatinase) انجام میشود.
ژلاتینازها پروتئازهایی (Protease) هستند که به صورت خارج سلولی توسط برخی باکتریها ترشح میشوند و ژلاتین را هیدرولیز یا هضم میکنند. تولید ژلاتینازها به عنوان یک آزمایش احتمالی برای شناسایی ارگانیسمهای مختلف از جمله گونههای استافیلوکوک (Staphylococcus)، انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) و برخی باسیلهای گرم مثبت، استفاده میشود.
اصول تست هیدرولیز ژلاتین
تست هیدرولیز ژلاتین جهت تعیین توانایی یک ارگانیسم در تولید آنزیمهای پروتئولیتیک (Proteolytic) خارج سلولی (ژلاتینازها (Gelatinase)) که ژلاتین (به عنوان یکی از اجزای بافت همبند مهرهداران) را به صورت مایع در میآورد، استفاده میشود.
این واکنش در دو مرحله متوالی انجام میشود: در واکنش اول ژلاتینازها، ژلاتین را به پلیپپتید (Polypeptide) هیدرولیز میکنند و سپس پلیپپتیدها مجدد به اسیدهای آمینه تبدیل میشوند. اسید آمینه توسط سلول جذب و برای اهداف متابولیکی استفاده میشود.
وجود ژلاتینازها با استفاده از محیط کشت نوترینت ژلاتین (Nutrient gelatin medium) تشخیص داده میشود. هنگامی که یک ارگانیسم ژلاتیناز تولید میکند، این آنزیم با هیدرولیز ژلاتین موجود در محیط، آن را به صورت مایع در میآورد.
محیط کشت
محیط کشت نوترینت ژلاتین
آنزماتیک دایجست ژلاتین (5 گرم)، عصاره گوشت گاو (3 گرم)، ژلاتین (120 گرم)، در 1000 میلیلیتر، pH برابر 6.8.
روش تست هیدرولیز ژلاتین
روشهای مختلفی برای تعیین تولید ژلاتیناز وجود دارد که همه آنها از ژلاتین به عنوان سوبسترا (Substrate) استفاده میکنند. روش استاندارد و متداولترین روش، استفاده از کشت عمقی (Stab) نوترینت ژلاتین است.
- ژلاتین را با 4 تا 5 قطره از کشت براث (Broth culture) 24 ساعته تلقیح کنید.
- محیط را تا 14 روز در دمای 35 تا 37 درجه سانتیگراد در هوای محیط انکوبه کنید.
توجه: اگر ارگانیسم در دمای 25 درجه سانتیگراد بهتر از 35 درجه سانتیگراد رشد میکند، محیط را در دمای 25 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
- روش دیگر، تلقیح عمیق ژلاتین از یک کلنی 24 ساعته با چهار یا پنج ضربه 0.5 اینچی در محیط کشت میباشد.
- لوله ژلاتین را برای بررسی مایع شدن آن، روزانه از انکوباتور خارج کرده و در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار دهید.
توجه: لوله را سر و ته یا کج نکنید، زیرا گاهی اوقات مایع شدن قابل تشخیص يلاتین، تنها در بالای جایی که تلقیح انجام شده است رخ میدهد.
- لولهای که نقش کنترلی دارد و تلقیح نشده را همراه با لوله تلقیح شده در یخچال قرار دهید. مایع شدن تنها پس از سفت شدن لوله کنترل تعیین میشود.
توجه: در برخی موارد، پلیتها (Plate) با سولفات آمونیوم اشباع شده پر میشوند تا موجب رسوب ژلاتین هیدرولیز نشده شده که باعث ایجاد نواحی شفافی میشود. نتایج اغلب در عرض 5 تا 10 دقیقه پس از پر کردن با سولفات آمونیوم اشباع شده، مشاهده میشود.
نتایج مورد انتظار
مثبت: مایع شدن جزئی یا کلی لوله تلقیح شده (لوله کنترل باید کاملاً جامد باشد) در دمای 4 درجه سانتیگراد ظرف 14 روز. در پلیت، هیدرولیز ژلاتین با نواحی شفاف اطراف کلنیهای مثبت ژلاتیناز، نشان داده میشود.
منفی: انجماد کامل لوله در دمای 4 درجه سانتیگراد. در پلیت، هیچ ناحیه شفافی در اطراف کلنیها مشاهده نمیشود.
موارد استفاده
- تست هیدرولیز ژلاتین جهت تعیین توانایی ارگانیسمی که ژلاتیناز تولید میکند، استفاده میشود.
- این تست در شناسایی و افتراق گونههای سراتیا (Serratia)، پروتئوس (Proteus)، باسیلوس (Bacillus)، کلستریدیوم (Clostridium)، سودوموناس (Pseudomonas) و فلاووباکتریوم (Flavobacterium) مفید است.
- تست هیدرولیز ژلاتین استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus) که بیماریزا و ژلاتیناز مثبت است از اپیدرمیدیس (Epidermidis) غیر بیماریزا که ژلاتیناز منفی است، متمایز میکند.
- تست هیدرولیز ژلاتین میتواند برای افتراق گونههای سراتیا و پروتئوس که ژلاتین مثبت هستند از سایر اعضای خانواده انتروباکتریاسه استفاده شود.
- باسیلوس آنتراسیس (Bacillus anthracis)، باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus) و چندین عضو دیگر این دسته از باکتریها، به همراه کلستریدیوم تتانی (Clostridium tetani) و پرفرنجنس (perfringens)، ژلاتیناز مثبت هستند.
محدودیتهای تست هیدرولیز ژلاتین
- برخی از اگانیسمها ممکن است در این محیط رشد ضعیفی داشته باشند یا اصلا رشد نکنند.
- ژلاتین در دمای بالای 20 درجه سانتیگراد، به صورت مایع است. بنابراین تعیین نتایج باید پس از سرد کردن محیط انجام شود.
- ژلاتیناز معمولا در سطح محیط کشت عمل میکند. تکان دادن لوله در حالی که گرم است، ممکن است منجر به تفسیر منفی کاذب شود.
همچنین بخوانید:
- تست آمینو اسید دکربوکسیلاز: روش، موارد استفاده و تفسیر نتایج
- تست هیدرولیز کازئین: اصول، روش، کاربرد و تفسیر
- تست بایل اسکولین (Bile Esculin Test): اصول، روش، کاربرد و تفسیر
- تست براث پیروات (Pyruvate Broth Test): اصول، روش، کاربرد و تفسیر
- تست بتالاکتاماز: اهداف، اصول، روش و نتایج
مترجم: صادق حسینیکیا
