تست Before and after یا تست قبل و بعد از ایندیوسر برای بررسی تایید تولید پروتئین در سویه ای که وکتور حاوی ژن وارد آن شده
تست “قبل و بعد از ایندیوسر” یکی از روش‌های رایج و اساسی در بررسی تایید تولید پروتئین در باکتری‌ها یا سلول‌های ترانسفکت شده با وکتورهای ژنی است. این تست به طور معمول در فرآیند تولید پروتئین‌های نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد تا به کمک آن بتوان تولید پروتئین مورد نظر را در سلول‌ها یا باکتری‌هایی که ژن مورد نظر به آن‌ها انتقال داده شده است، ارزیابی کرد.
در این نوع تست، هدف اصلی بررسی تغییرات در تولید پروتئین قبل و بعد از ایندیوسر (inducer) است. ایندیوسر به عنوان یک مولکول شیمیایی عمل می‌کند که با وارد کردن آن به محیط کشت، ترانسکریپشن (تولید RNA) و در نتیجه ترانسلیشن (تولید پروتئین) ژن وارد شده در وکتور را فعال می‌کند. معمولاً ایندیوسرها در سیستم‌های اکسپرسیونی مبتنی بر باکتری‌ها مانند E. coli یا در سیستم‌های سلولی دیگری که از وکتورهای پلاسمیدی برای وارد کردن ژن استفاده می‌کنند، به کار می‌روند. سیستم‌های اکسپرسیونی که به طور معمول از ایندیوسرها استفاده می‌کنند شامل سیستم‌های مبتنی بر پروموتورهای قابل اینداکشن مانند پروموتورهای T7، lac، یا araC هستند. ایندیوسرهایی که معمولاً استفاده می‌شوند شامل IPTG (ایزوپروبیتیل-β-دی‌گالاکتوزید) برای سیستم‌های مبتنی بر پروموتور lac یا L-arabinose برای سیستم‌های مبتنی بر پروموتور araC هستند.
در تست قبل و بعد از ایندیوسر، ابتدا سلول‌های ترانسفکت شده یا باکتری‌های حاوی وکتور ژنی به مدت زمانی مشخص در محیط کشت مناسب رشد می‌کنند. سپس ایندیوسر به محیط کشت اضافه می‌شود تا فرآیند تولید پروتئین آغاز شود. نمونه‌هایی از سلول‌ها یا باکتری‌ها قبل و بعد از افزودن ایندیوسر برای تحلیل مقایسه‌ای برداشت می‌شود. این نمونه‌ها می‌توانند برای اندازه‌گیری میزان پروتئین تولید شده مورد استفاده قرار گیرند. میزان پروتئین در این آزمایش معمولاً با استفاده از روش‌های مختلفی مانند SDS-PAGE (الکتروفورز در ژل پلی‌اکریل‌آمید) و تحلیل غربی (Western blotting) اندازه‌گیری می‌شود. این روش‌ها به محققان این امکان را می‌دهند که مشاهده کنند آیا پروتئین مورد نظر به طور مؤثری پس از اینداکشن (اضافه کردن ایندیوسر) تولید شده است یا خیر.
یکی از مهم‌ترین جنبه‌های این تست، بررسی تغییرات در میزان بیان پروتئین قبل و بعد از افزودن ایندیوسر است. به طور کلی، هنگامی که ایندیوسر به محیط کشت اضافه می‌شود، باید یک افزایش معنادار در میزان پروتئین هدف دیده شود، که نشان‌دهنده عملکرد صحیح و موفقیت‌آمیز سیستم اکسپرسیونی است. در غیر این صورت، اگر هیچ تغییر معناداری در تولید پروتئین مشاهده نشود، ممکن است اشکالی در سیستم وجود داشته باشد که نیاز به بررسی بیشتر داشته باشد. عواملی که می‌توانند بر نتایج تست تأثیر بگذارند شامل غلظت ایندیوسر، زمان اضافه‌سازی ایندیوسر، شرایط رشد باکتری یا سلول‌های ترانسفکت شده، و همچنین شرایط محیطی مانند دما و pH هستند.
در بسیاری از آزمایشات، علاوه بر بررسی حضور یا غیاب پروتئین هدف، کیفیت پروتئین تولید شده نیز بررسی می‌شود. به عنوان مثال، آیا پروتئین به طور کامل یا به صورت فرم غیر فعال تولید شده است؟ برای این منظور می‌توان از روش‌های مختلفی مانند الکتروفورز برای تفکیک پروتئین‌ها و همچنین از تکنیک‌هایی مثل ترسیم طیف‌سنجی جرمی (Mass Spectrometry) برای شناسایی و تعیین کیفیت پروتئین تولیدی استفاده کرد. همچنین، استفاده از تکنیک‌های غربی برای شناسایی پروتئین‌های خاص، با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی برای پروتئین مورد نظر، می‌تواند به تایید موفقیت‌آمیز بودن تولید پروتئین کمک کند.
از دیگر نکات مهم در این تست، ارزیابی مقدار پروتئین تولیدی است. معمولاً برای سنجش میزان پروتئین از روش‌های اندازه‌گیری غلظت پروتئین مانند روش Bradford، BCA یا Lowry استفاده می‌شود. این روش‌ها به محققان این امکان را می‌دهند که مقدار پروتئین را به طور کمی اندازه‌گیری کرده و در نهایت از آن برای مقایسه میزان تولید پروتئین قبل و بعد از افزودن ایندیوسر استفاده کنند. در این مرحله، اغلب سلول‌ها یا باکتری‌های نمونه قبل و بعد از اینداکشن، باید برای استخراج پروتئین به روش‌های متداول مانند لیز سلولی مورد بررسی قرار گیرند. سپس پروتئین استخراج شده از طریق روش‌های مناسب اندازه‌گیری می‌شود تا نتایج قابل مقایسه‌ای در مورد تولید پروتئین فراهم گردد.
در برخی موارد، این تست به محققان این امکان را می‌دهد که شرایط بهینه برای تولید پروتئین را شناسایی کنند. به عنوان مثال، اگر با تغییر دما، زمان اینداکشن یا غلظت ایندیوسر نتایج بهتری به دست آید، این اطلاعات می‌تواند برای بهینه‌سازی فرآیند تولید پروتئین در مراحل بعدی استفاده شود. همچنین، این تست می‌تواند به شناسایی مشکلات احتمالی در سیستم اکسپرسیونی کمک کند، مانند مسدود شدن پروتئین هدف در بدنۀ سلولی، عدم تخلیص مناسب پروتئین، یا عدم انحلال پروتئین در محیط کشت. این موارد می‌توانند به محققان راهنمایی کنند تا به طور مؤثرتر مشکلات سیستم اکسپرسیونی را شناسایی و حل کنند.
در نهایت، یکی از کاربردهای مهم این تست در زمینه تحقیقاتی و صنعتی مربوط به تولید پروتئین‌های نوترکیب است که در کاربردهای دارویی، غذایی و بیوتکنولوژی استفاده می‌شود. این تست به محققان کمک می‌کند تا پروتئین‌های مورد نظر خود را در مقیاس بزرگ‌تر تولید کرده و آن‌ها را برای آزمایش‌های بالینی یا سایر کاربردهای عملی آماده کنند. بنابراین، تست قبل و بعد از ایندیوسر یکی از ابزارهای اساسی در بیوتکنولوژی است که به محققان این امکان را می‌دهد که تولید پروتئین‌ها را کنترل کرده و شرایط بهینه برای تولید مؤثرتر آن‌ها را شناسایی کنند.
همچنین بخوانید:
