تست LAP: اصول، روش، نتایج و موارد استفاده

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تست LAP (تست لوسین آمینوپپتیداز)

تست LAP برای افتراق و شناسایی باکتری‌های کوکسی (Cocci) گرم مثبت کاتالاز (Catalase) منفی استفاده می‌شود. این تست به طور خاص برای تشخیص گونه‌های استرپتوکوک (Streptococcus)، انتروکوک (Enterococcus)، پدیوکوک (Pediococcus) و لاکتوکوکوس (Lactococcus) از گونه‌های آئروکوک (Aerococcus) و لوکونوستوک (Leuconostoc) استفاده می‌شود.

آمینوپپتیدازهای لوسین (Leucine aminopeptidases (LAP))، متالوپپتیدازهایی (Metallopeptidases) هستند که بقایای لوسین (Leucine) را از انتهای N پروتئین‌ها یا/و پپتیدها هیدرولیز می‌کنند. آن‌ها آنزیم‌های پروتئولیتیک (Proteolytic) در خانواده پپتیداز (Peptidase) هستند که به متابولیسم پروتئین‌ها برای بقای باکتری و همچنین به بیماری‌زایی آن کمک می‌کنند.

با این حال همه باکتری‌ها توانایی سنتز آمینوپپتیدازهای لوسین را ندارند. از این رو تشخیص تولید LAP یک تکنیک مهم برای طبقه‌بندی باکتری‌ها است. تست LAP به عنوان یک تست بیوشیمیایی در آزمایشگاه میکروبیولوژی برای طبقه‌بندی باکتری‌ها به عنوان گروه‌های تولیدکننده آمینوپپتیداز لوسین و گروه‌های غیر تولیدکننده آمینوپپتیداز لوسین استفاده می‌شود.

اهداف تست LAP

ارزیابی توانایی باکتری‌ها در سنتز آنزیم‌های آمینوپپتیداز لوسین
برای افتراق و شناسایی احتمالی باکتری‌های کوکسی گرم مثبت کاتالاز منفی

اصول تست LAP

آنزیم‌های آمینوپپتیداز لوسین که توسط باکتری‌ها سنتز شده، اجزای لوسین-p-نفتیل‌آمید (Leucine-p-naphthylamide) را در دیسک LAP هیدرولیز می‌کنند. هیدرولیز لوسین-p-نفتیل آمید توسط آنزیم‌های LAP باعث آزاد شدن لوسین و β-نفتیل‌آمید آزاد می‌شود. بتا نفتیل‌آمید آزاد با شناساگر سینامالدئید (N, N- دی‌متیل‌آمینوسینامالدئید (N, N-dimethylaminocinnamaldehyde)) واکنش داده و باز شیف (Schiff) به رنگ صورتی روشن یا قرمز گیلاسی را تشکیل می‌دهد که نشان دهنده مثبت بودن تست LAP است.

نیازمندی‌های تست LAP

شناساگرها

دیسک‌های LAP (دیسک‌های آغشته به لوسین-p-نفتیل‌آمید)
شناساگر LAP

p-N,N-دی‌متیل‌آمینوسینامالدئید به عنوان یک شناساگر LAP استفاده می‌شود. شناساگر PYR و شناساگر LAP یکسان هستند.

ترکیب شناساگر LAP:

N,N-دی‌متیل‌آمینوسینامالدئید: 1 گرم
اسید هیدروکلریک غلیظ (HCl): 10 میلی‌لیتر
آب مقطر: 990 میلی‌لیتر

روش آماده‌سازی شناساگر PYR

1 گرم N,N-دی‌متیل‌آمینوسینامالدئید را به 990 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه و به آرامی 10 میلی‌لیتر HCl غلیظ را با هم زدن مداوم اضافه کنید.
به خوبی مخلوط کنید تا N,N-دی‌متیل‌آمینوسینامالدئید کاملا حل شود.
شناساگر را در دمای 2 تا 8 درجه سانتی‌گراد در جای تاریک نگه‌داری کنید.

آب مقطر

تجهیزات مورد نیاز

پتری پلیت‌ها (Petri plate)

چراغ بونزن (Bunsen burner)

لوپ تلقیح

فورسپس یا پنس (Forceps)

PPE و سایر لوازم آزمایشگاهی عمومی

ارگانیسم‌های تستی (باکتری نمونه)

کنترل مثبت: Enterococcus faecalis ATCC 29212
کنترل منفی: Aerococcus viridans ATCC 11563

روش تست LAP

یک دیسک LAP را با پنس در یک پتری پلیت استریل قرار دهید.

دیسک را با آب مقطر استریل مرطوب کنید.
با استفاده از یک لوپ تلقیح استریل، 1 یا 2 لوپ پر از باکتری‎های نمونه که به خوبی ایزوله شده را بردارید و آن‌ها را روی دیسک LAP بمالید.
پلیت را به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق به صورت هوازی انکوبه کنید.
1 تا 2 قطره از شناساگر LAP را روی دیسک LAP بارور شده، بریزید.
تغییر رنگ را پس از 2 دقیقه بعد از افزودن شناساگر بررسی کنید.

نتیجه و تفسیر تست LAP

ایجاد رنگ صورتی روشن یا قرمز گیلاسی یا قرمز مایل به ارغوانی روی دیسک پس از 2 دقیقه بعد از افزودن شناساگر LAP، نشان دهنده واکنش مثبت (تست LAP مثبت) است.
ایجاد رنگ صورتی نشان دهنده یک واکنش ضعیف است و مثبت در نظر گرفته می‌شود.
عدم تغییر رنگ یا تشکیل رنگ زرد یا رنگ نارنجی پس از افزودن شناساگر LAP نشان دهنده واکنش منفی (تست LAP منفی) است.

باکتری‌های مثبت در تست LAP

گونه‌های استرپتوکوکوس (Streptococcus)، انتروکوکوس (Enterococcus)، لاکتوکوکوس (Lactococcus)، و پدیوکوکوس (Pediococcus).

باکتری‌های منفی در تست LAP

گونه‌های لوکونوستوک (Leuconostoc)، آئروکوکوس (Aerococcus)، تتراژناکوکوس (Tetragenacoccus) و غیره (برخی از گونه‌های آئروکوک (Aerococcus) نتایج متغیری می‌دهند (آئروکوکوس ادراری (Aerococcus urinae) ممکن است نتایج مثبت بدهد)).

کنترل کیفیت

انتروکوکوس فکالیس ATCC 29212 که منجر به تشکیل رنگ صورتی روشن (قرمز) روی دیسک در عرض 1 تا 2 دقیقه پس از افزودن شناساگر LAP می‌شود.
آئروکوکوس ویردانس ATCC 11563 که پس از افزودن شناساگر LAP رنگ صورتی یا قرمز تشکیل نمی‌دهد (رنگ آن تغییر نمی‌کند).

اقدامات احتیاطی

دیسک LAP و شناساگر را در شرایط سرد و تاریک نگه‌داری کنید.
دیسک LAP را با آب مقطر اشباع نکنید، فقط آن را کمی مرطوب کنید.
یک تلقیح سنگین را بر روی دیسک بمالید. استفاده از تلقیح خیلی کوچک ممکن است نتایج منفی کاذب داشته باشد یا ممکن است منجر به تشکیل رنگ صورتی کم‌رنگ شود.

کاربردهای تست LAP

افتراق و شناسایی قطعی کوکسی‌های کاتالاز منفی و گرم مثبت.

محدودیت‌های تست LAP

کاربرد این تست فقط به باکتری‌های کوکسی کاتالاز منفی و گرم مثبت محدود می‌شود.
تلقیح ناکافی ممکن است نتایج منفی کاذب بدهد.
این تست برای شناسایی کامل باکتری‌ها کافی نیست. از این رو نیاز به آزمایش‌های بیوشیمیایی دیگری برای تأیید شناسایی باکتری‌های نمونه دارد.

مطالب مرتبط: