تفاوت بین ژل آگارز و پلی اکریل آمید چیست؟

فهرست مطالب نمایش

تفاوت بین ژل آگارز و پلی اکریل آمید به صورت عمده وجود دارد که منجر به کاربردهای متمایز آنها در آزمایشگاه تحقیقاتی می‌شود.

اولین تفاوت سمیت است. آگارز سمی نیست، در حالی که پودرها و ژلهای پلی اکریل آمید نسبتاً خطرناک در نظر گرفته می‌شوند و در حین جابجایی نیاز به توجه و مراقبت دارند.
دومین تفاوت بین این دو ماده پیچیدگی مولکولی است. آگارز پیچیده است و دارای شکاف‌های بزرگی در بین مولکولهای تشکیل دهنده ماتریس ژل است. پلی اکریل آمید تنها از یک نوع مولکول بزرگ تشکیل شده است که دارای شکافهای بسیار کوچکتری است، اگرچه اندازه نوارها ممکن است متفاوت باشد.
سومین تفاوت در تهیه ژل، جهت ریزش است. آگارز به صورت افقی و پلی اکریل آمید به صورت عمودی ریخته می‌شود. از آنجایی که ریختن عمودی به خوبی انجام نمی‌شود، ژلها معمولاً از قبل ساخته می‌شوند. آماده سازی آگارز کمی اقتصادی‌تر است و در صورت لزوم میتوان آن را ذوب کرد و دوباره ریخت.

ژلهای آگارز به دلیل اندازه بزرگتر بیومولکولها با DNA استفاده می‌شوند (قطعات DNA اغلب هزاران کیلو دالتون هستند). پلی اکریل آمید برای ژلهای پروتئینی، وضوح مناسبی دارد، زیرا اندازه‌های بسیار کوچک (50 کیلو دالتون معمولی است) برای شکافهای بین مولکولی کوچک در ژل مناسبتر است.

در آماده سازی هر دوی این ژلها تفاوتهایی وجود دارد و انتخاب و نوع ژل باید با دقت برای هر آزمایش انتخاب شود. انتخاب مایع ژل مناسب نیز بستگی به این دارد که کدام ماده انتخاب شده است، زیرا برخی از رنگها، در هر محیط متفاوت عمل می‌کنند.

نحوه آماده سازی ژل آگارز و پلی اکریل آمید

الکتروفورز با ژل آگارز و پلی اکریل آمید یکی از پرکاربردترین ابزارها در زیست شناسی مولکولی است. ژل روشی ساده و کم هزینه برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک بر اساس اندازه برای تعیین کمیت و خالص سازی ارائه می‌کنند.

آگارز در مقایسه با ژل پلی اکریل آمید

از ژل آگارز میتوان برای جداسازی قطعات بزرگ DNA استفاده کرد. ژلهای پلی اکریل آمید برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک کوتاهتر، معمولاً در محدوده 1-1000 جفت باز، بر اساس غلظت به کار رفته استفاده می‌شود. این ژلها را میتوان با دناتورانت یا بدون آن اجرا کرد. ژلهایی که بدون دناتورانت اجرا می‌شوند، ژلهای بومی نامیده می‌شوندDNA یا RNA بسته به ساختار ثانویه‌شان با سرعتهای متفاوتی حرکت می‌کنند. ژلهای بومی به DNA یا RNA اجازه میدهند تا دو رشته‌ای باقی بمانند.

افزودن یک دناتورانت به ژل، مانند اوره، عموماً تمام اسیدهای نوکلئیک را تک رشته‌ای میکند. ساختار ثانویه در ژلهای دناتوره کننده تشکیل نمی‌شود و بنابراین، تنها طول DNA بر تحرک تأثیر میگذارد.

غلظتهای مختلف آگارز و اکریل آمید برای بهینه سازی تفکیک اسیدهای نوکلئیک با طولهای مختلف ضروری است. غلظتهای پیشنهادی در جدول 1 در زیر نشان داده شده است.

ملاحظات ایمنی

اکریل آمید یک نوروتوکسین قوی است و به شکل پودری میتواند به راحتی در هوا پخش شود. هنگام وزن کردن مواد، حتما از حفاظ شخصی مناسب، از جمله دستکش و ماسک استفاده کنید. بسیاری از شرکتها اکریل آمید محلول در آب یا ژلهای پیش ساخته را میفروشند. این محصولات کمی گرانتر هستند اما خطر استنشاق اکریل آمید را کاهش میدهند.

اتیدیوم بروماید رایج ترین رنگ DNA موجود است. همچنین در صورت استنشاق سمی است، با حرارت دادن تجزیه می‌شود و گازهای سمی تولید میکند و باعث ایجاد نقص ژنتیکی میشود.

همیشه دستکش بپوشید و از قرار دادن مایعات حاوی اتیدیوم بروماید در مایکروویو خودداری کنید. رنگهای فلورسنت غیر جهش زا موجود به عنوان جایگزین شامل Bio-Safe™ (Bio-Rad)، SYBR-safe™ (ThermoFisher Scientific) و GelRed® Nucleic Acid Stain (محصولات تحقیقاتی Phenix) می باشد. این مایع‌ها در حالی که گران‌تر از اتیدیوم بروماید هستند، نیاز به جداسازی و ضدعفونی کردن ایستگاه‌های الکتروفورز ژل را کاهش می‌دهند. توجه داشته باشید که اتیدیوم بروماید تنها به DNA دو رشته ای متصل می‌شود و بنابراین، رنگ خوبی برای تجزیه و تحلیل DNA تک رشته‌ای نیست.

نکاتی برای الکتروفورز ژل اکریل آمید

از پرسولفات آمونیوم تازه (APS) استفاده کنید – APS پلیمریزاسیون اکریل آمید را کاتالیز میکند. استفاده از APS یا APS قدیمی که در بالای 20- درجه سانتیگراد ذخیره شده است باعث پلیمریزاسیون آهسته یا ناقص می‌شود. مقادیر کم و تازه را در فریزر نگهداری کنید.
آگاهی داشته باشید که رنگ(های) مارکر شما چگونه روی ژل حرکت می‌کنند—در ژلهای آگارز، بروموفنول بلو و زایلن سیانول به ترتیب تقریباً 300 و 3000 جفت باز حرکت می‌کنند. این رنگها با سرعتهای متفاوتی در ژلهای اکریل آمید بسته به چگالی ژل حرکت می‌کنند. جدول 2 نرخ حرکت تقریبی را بر حسب اندازه نسبی DNA تک رشته ای/دناتوره شده ارائه می دهد.
TAE یا TBE؟ ژلهای آگارز معمولاً از بافرهای Tris-Acetic Acid-EDTA (TAE) یا Tris-Boric Acid-EDTA (TBE) استفاده می‌کنند. بافر TAE این مزیت را دارد که میتواند در محلولهای استوک 50X ساخته شود. با این حال، بافر کمتری دارد و در برخی موارد، استفاده از آن باعث ایجاد نوارهای لکه دار می‌شود. ژلهای بافر TBE نوارهای شارپ بهتری تولید می‌کنند، به ویژه در هنگام استفاده از قطعات DNA با اندازه کوچک و میتوانند در ولتاژهای بالاتر اجرا شوند. با این حال، بورات موجود در TBE میتواند برخی از آنزیمها – از جمله T4 DNA لیگاز – را در DNA خالص شده از این ژلها مهار کند.
از چه ولتاژی استفاده کنیم؟ ژلهای آگارز را میتوان در طیف وسیعی از ولتاژها – از 0.25-7 V/cm استفاده کرد. ولتاژ بالا باعث صرفه جویی در زمان می‌شود اما میتواند منجر به گرم شدن بیش از حد ژل شود و حتی منجر به ذوب شدن ژلهای آگارز با درصد پایین شود. ولتاژ بالا همچنین میتواند باعث لکه دار شدن باند، به ویژه قطعات بیش از 10 کیلوبایت شود. شارپ‌ترین نوارها را میتوان با اجرای ژل در TBE در تاریکی با ولتاژ 0.25-0.5 V/cm بدست آورد.