تفاوت بین PCR Basic و Real time PCR در چیست؟

تکامل PCR به real time PCR:

PCR در شناسایی RNA و DNA کاملاً انقلابی ایجاد کرده استPCR. پایه از زمان تشخیص در نقطه انتهایی واکنش (End-point) نسبت به تشخیص در هنگام وقوع واکنش (Occurring) پیشرفت کرده است.

Real-Time در مقابل PCR سنتی:

شیمی در Real time PCR امکان تشخیص تقویت PCR را در مراحل اولیه واکنش فراهم می کند. اندازه گیری سینتیک واکنش در مراحل اولیه PCR یک مزیت مشخص نسبت به تشخیص PCR سنتی دارد. در روش های سنتی از ژل های آگارز برای تشخیص تقویت PCR در فاز نهایی یا نقطه پایان واکنش PCR استفاده می شود.

محدودیت های :PCR End-Point

نتایج ژل آگارز از نقطه انتهایی واکنش به دست می آید. تشخیص نقطه پایانی بسیار وقت گیر است. نتایج ممکن است روزها بدست نیاید. نتایج بر اساس تفاوت در اندازه است ، که ممکن است خیلی دقیق نباشد. همانطور که بعدا در ادامه مشاهده می شود ، نقطه پایان از نمونه به نمونه متغیر است. در حالی که ژل ها قادر به حل این تغییرات در عملکرد نیستند ، PCR در زمان واقعی (Real time PCR) به اندازه کافی حساس است تا این تغییرات را تشخیص دهد. وضوح ژل آگارز بسیار ضعیف است ، حدود 10 تقسیم ولی real time PCR می تواند تغییری کمتر از دو برابری را تشخیص دهد.

برخی از مشکلات مربوط به تشخیص نقطه نهایی:

دقت ضعیف
حساسیت کم
وضوح کم
غیر خودکار
فقط تفاوت مبتنی بر اندازه
نتایج به صورت عدد بیان نمی شوند (کیفی)
اتییدیم برمید برای رنگ آمیزی بسیار کمی نیست
پروسه قبل از PCR طولانی است

تفاوت بین PCR Basic و Real time PCR در چیست؟

همانطور که در شکل می بینید ، نمونه های موجود در ژل به ترتیب شامل 10 نسخه و 50 نسخه است. مشاهده تفاوت بین تغییر 5 برابری ژل آگارز سخت است. Real time PCR می تواند یک تغییر دو برابری را تشخیص دهد (یعنی 10 در مقابل 20 نسخه).

مراحل اساسی PCRپای:

برای درک اینکه چرا PCR (END-point) محدود است ، درک این مسئله که در اثر واکنش PCR چه اتفاقی می افتد مهم است.

اجرای PCR Basic را می توان به سه مرحله تقسیم کرد:

نمایی. انباشته شدن نمونه در طی دو برابر شدن دقیق محصول در هر چرخه (با فرض 100٪ بازده واکنش). واکنش بسیار خاص و دقیق است.
خطی. اجزای واکنش در حال مصرف هستند ، واکنش کند می شود و محصولات شروع به تخریب می کنند.
Plateau. واکنش متوقف شده است ، دیگر محصولی ساخته نمی شود و اگر به مدت کافی باقی بماند ، محصولات PCR شروع به تخریب می کنند.

با این حال ، با پیشرفت واکنش ، برخی از معرف ها در نتیجه تقویت مصرف می شوند. این کاهش در نرخ های مختلف برای هر تکرار اتفاق می افتد. واکنش ها کند می شوند و محصول PCR در هر چرخه دیگر دو برابر نمی شود. این تقویت خطی را می توان در مرحله خطی واکنش مشاهده کرد.

سرانجام واکنش ها کند و متوقف می شوند و همه در کنار هم یا در فلات (Plateau) متوقف می شوند. هر لوله یا واکنش به دلیل وجود سینتیک واکنش متفاوت برای هر نمونه ، در یک نقطه متفاوت قرار موقف می شوند. این اختلافات را می توان در فاز فلات مشاهده کرد. مرحله فلات جایی است که PCR سنتی اندازه گیری خود را انجام می دهد ، همچنین به عنوان تشخیص نقطه انتهایی شناخته می شود.

کمی سازی:

از لحاظ تئوریک ، بین مقدار شروع نمونه هدف و مقدار محصول PCR در هر تعداد چرخه رابطه ای کمی وجود دارد.

Real time PCR تجمع آمپلیکن را در هنگام واکنش تشخیص می دهد. سپس داده ها در مرحله نمایی واکنش PCR اندازه گیری می شوند. در روشهای سنتی PCR از ژلهای آگارز یا سایر روشهای تشخیص پس از PCR استفاده می شود که دقیق نیستند. همانطور که قبلا ذکر شد ، مرحله نمایی نقطه بهینه برای تجزیه و تحلیل داده ها است. Real-Time PCR سنجش DNA و RNA را نسبت به روشهای گذشته آسان و دقیق می کند.

رنگ سبز :SYBR

شیمی SYBR GREENیک روش جایگزین است که برای انجام آنالیز PCR در زمان واقعی (Real time PCR) استفاده می شود. SYBR GREEN رنگی است که به شیار مینور DNA دو رشته ای متصل می شود. وقتی رنگ SYBR Green به DNA دو رشته ای متصل می شود ، شدت انتشار فلورسنت افزایش می یابد. با تولید آمپلیکنهای دو رشته بیشتر ، سیگنال رنگ SYBR Green افزایش می یابد. در شکل زیر کل روند هر نوع شیمی در زمان واقعی نشان داده شده است.

کاربرد های Real time PCR:

Real time PCR می تواند برای برنامه های PCR سنتی و همچنین برنامه های جدید کاربردی که با PCR سنتی کمتر موثر بوده اند ، اعمال شود.