تکنیک ها
توالییابی چیست؟
توالییابی DNA به معنای تعیین ترتیب بازهای تشکیل دهنده ی مولکول DNA است. توالییابی به دانشمندان نشان میدهد که چه نوع اطلاعات ژنتیکی در هر بخش DNA حمل می شود. به عنوان مثال ، دانشمندان می توانند از اطلاعات توالی برای تعیین اینکه کدام قسمت از DNA حاوی ژن است و کدام بخشها مربوط به دستورالعمل های نظارتی هستند و میتوانند بر بخشهای دیگر اثر تنظیمی بگذارند مثل روشن یا خاموش کردن ژنها.
در مارپیچ دوگانه DNA ، هر کدام از چهار باز آلی عموما با یک باز یکسان پیوند می خورند و “جفت باز” را تشکیل می دهند. آدنین (A)با تیمین (T) و سیتوزین (C) با گوانین (G) جفت می شود. این جفت شدن اساس مکانیسمی است که توسط آن مولکول های DNA هنگام تقسیم سلول ها کپی می شوند ، و همچنین پایه و اساس بیشتر روش هایی است که در تعیین توالی DNA انجام می شود. ژنوم انسان شامل حدود 3 میلیارد جفت باز است که شامل دستورالعملهای لازم برای ساخت و ادامه حیات یک انسان میباشد.
- روش های تعیین توالی DNA
از زمان پیدایش فناوری تعیین توالی تا به امروز، روشهای بسیار متنوع و گوناگونی برای انجام آن طراحی و ارائه شدند .امروزه عموما از چند روش نوین توالییابی استفاده میشود که در مقالات بعدی به آنها مفصل میپردازیم.اکنون در ادامه ی این بحث به چند تا از مهمترین روشهای توالییابی در طول تاریخ پیدایش آن اشاره میکنیم.
- توالییابی سنگر: روش تعیین توالی سنگر توسط بیوشیمیدان انگلیسی، فردریک سنگر(Frederick Sanger)،در دهه 1970 کشف شد. روش سنگر یک روش توالییابی کلاسیک DNA است که از ddNTP های فلورسنت (dideoxynucleotides، N = A ، T ، G یا C) برای جلوگیری از افزودن نوکلئوتید دیگر استفاده می کند. در روش سنگر ابتدا نیاز به كلون كردن هـر نقطـه شـروع بـراي توليـد DNA تك رشتهاي بود.
- تعيين توالي ماكسام- گيلبرت(Maxam–Gilbert sequencing ): بين سالهاي 1976 تا 1977 توسـط آلـن ماكـسام (Allan Maxam)و والتـر گيلبرت(Walter Gilbert) ارائه شد که درواقع يك روش تعيين توالي بر اساس تغيير شيميايیDNA و متعاقب آن ايجاد شكاف در بازهاي خاص میباشد. روش پيـشنهادي این دو دانشمند به این دلیل که در آن DNA خـالص شـده مستقيماً قابل استفاده است، برخلاف روش سنگر که نیاز به کلون کردن داشت، به سرعت محبوبيت پيـدا كـرد. در هر صورت با پيشرفت روش خـتم زنجيرهسازي سنگر، روش تعيين تـوالي ماكـسام- گيلبـرت بـه دليـل پيچيـدگي روش، مـصرف فـراوان مـواد شـيميايي خطرنـاك و سخت بودن استفاده از اين روش در حجمِ انبوه نمونـه و عـدم كاربرد آن در كيتهاي استاندارد زيستشناسي محبوبيت خـود را از دست داد.
- توالییابی نسل بعدی ((NGS)Next Generation sequencing): این روش همچنین به عنوان توالییابی انبوه موازی(massively parallel sequencing) شناخته میشود.این روش تا حد زیادی مشابه روش سنگر است که بهبود یافته و مزایایی مانند توان بالا ، هزینه کمتر و سرعت عمل بیشتر را دارا است. NGS می تواند ترتیب توالی میلیون ها قطعه را به طور همزمان تعیین کند. توالییابی نسل بعد یک توالی کوتاه خواندنی است که نیاز به ساخت یک کتابخانه از قطعات کوچک دارد.
- توالییابی نسل سوم ، که به عنوان توالی خواندنی طولانی (long-read sequencing ) نیز شناخته میشود. از جملهی این روشهای توالییابی میتوان به (Single Molecular Real Time)SMRT و توالییابی نانوحفره آکسفورد (Oxford nanopore sequencing) اشاره کرد. با روش توالییابی نسل سوم می توان میلیاردها الگو از DNA و RNA را بررسی کرده و همزمان متیلاسیون های متغیر را تشخیص بدهیم. روش های این نسل میتوانند تغییرات بیشتری را تشخیص دهند، که برخی از آنها را با روش های تعیینتوالی که تنها قادر به بررسی توالی های کوتاه هستند، نمی توان تشخیص داد.
- کاربردهای فناوریهای توالییابی DNA
دانشمندان می توانند از اطلاعات توالی برای شناسایی ژنها و دستورالعمل های نظارتی موجود در مولکول DNA استفاده کنند. توالی DNA را می توان برای بررسی ویژگی های مشخص در ژنها را، مانند قالب های خواندن توالی (ORFs)و جزایر CpG(ناحیه‌ای از ژنوم است که فرکانس بالایی از زوج بازهای CG در آن وجود دارد) ، غربالگری کرد. توالی DNA همولوگ موجودات مختلف را میتوان برای تجزیه و تحلیل تکاملی بین گونه ها یا جمعیت ها مقایسه کرد همچنین با کمک تعیین توالی DNA می توان تغییراتی در ژن را که ممکن است باعث بیماری شود شناسایی کرد.
- توالییابی RNA
تکنیکی است که در آن می توان کمیت و توالی RNA را در یک نمونه با استفاده از توالی یابی نسل بعدی (NGS) مورد بررسی قرار داد. این تکنیک رونویسی الگوهای بیان ژنی را که در RNA ما کدگذاری شده است ، تجزیه و تحلیل میکند. در ادامه دلیل اهمیت توالی یابی RNA ، و کاربردهای مهم آن که امروزه معمولاً مورد استفاده قرار می گیرد را مورد بررسی قرار میدهیم.
- کاربردهای فناوری توالی یابی RNA
این فناوری به ما اجازه میدهد تا رونویسی کل RNAهای محتوای سلولی شامل mRNA ، rRNA و tRNA را بررسی کنیم. اگر بخواهیم اطلاعات ژنوم خود را با بیان پروتئینی عملکردی آن مرتبط کنیم ، درک رونویسی بسیار مهم است. تعیین توالی RNA میتواند به ما بگوید که کدام ژن ها در سلول روشن میشوند ، میزان بیان آنها چگونه است و در چه زمانی غیرفعال یا خاموش میشوند. این به دانشمندان اجازه میدهد تا زیستشناسی یک سلول را عمیق تر درک کرده و تغییراتی را که ممکن است نشان دهنده بیماری باشد ارزیابی کنند. برخی از رایج ترین تکنیک هایی که در تعیین توالی RNA استفاده میشوند عبارتند از: شناسایی SNP ، ویرایش RNA و تجزیه و تحلیل بیان ژن دیفرانسیلی.
در توالییابی RNA از توالیهای کوتاه mRNA استفاده میشود که عاری از DNA غیر کدکننده داخلی است. پس این توالی ها باید در نهایت با ژنوم مرجع همردیف شوند.
ترجمه: آتوسا بهنام راد
مطالعات بیشتر در بخش راهنمای علمی سایت
