تکنیک‌های مختلف آسپتیک در آزمایشگاه میکروبیولوژی

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تکنیک‌های مختلف آسپتیک در آزمایشگاه میکروبیولوژی

تکنیک آسپتیک مجموعه‌ای از روش‌های معمول است که برای جلوگیری از آلودگی محیط کشت‌های استریل، کشت‌ها و همچنین سایر محلول‌ها توسط میکروارگانیسم‌های مضر (به عنوان مثال سپسیس) استفاده می‌شود. این اقدامات گاهی اوقات به عنوان “روش استریل” توصیف می شوند، اصطلاح “تکنیک استریل” تنها در صورتی مناسب است که به جلوگیری از ورود هرگونه میکروارگانیسم به تجهیزات پزشکی یا معرف ها (به عنوان مثال، در طول اعمال جراحی) اشاره داشته باشد.

از آنجایی که هدف زیست شناسان کشت میکروارگانیسم ها یا سلول های یوکاریوتی بدون معرفی هیچ گونه ارگانیسم خارجی است، روش های آسپتیک برای اطمینان از انجام آزمایش ها با دقت و صحت ضروری هستند. همیشه به خاطر داشته باشید که محیط کاری کاملاً ایمن برای دانشمندان وجود ندارد. با این حال، بسیاری از شیوه‌های رایج و مبتنی بر عقل سلیم برای کاهش احتمال آلودگی در کشت وجود دارد. روش‌های آسپتیک، احتمال آلودگی کشت توسط میکروارگانیسم‌های موجود در محیط یا آلودگی محیط توسط میکروارگانیسم‌های مورد آزمایش را محدود می‌کند.

نمونه‌هایی از تکنیک آسپتیک

تکنیک‌های آسپتیک شامل موارد زیر است:

تمیز کردن و ضدعفونی کردن سطوح آزمایشگاه قبل از استفاده
محدود کردن مدت زمانی که محیط کشت یا کشت بدون درپوش و در معرض هوا قرار می‌گیرد
همیشه بستن درب پتری دیش‌ها
استریل کردن موثر حلقه‌های تلقیح و سایر وسایلی که با محیط کشت یا کشت‌ها تماس پیدا می‌کنند.
خودداری از تنفس روی وسایل استریل یا کشت‌ها

قوانین قابل اجرا برای هر تکنیک آسپتیک

هنگام استفاده از هر روش آسپتیک، باید دستورالعمل‌های کلی را رعایت کرد:

درپوش‌ها و پنجره‌ها را برای جلوگیری از جریان هوا و حرکات ناگهانی که باعث آشفتگی هوا می‌شود، ببندید.
انتقالات را روی سطحی که ضدعفونی شده انجام دهید. به دلیل اثر سریع، ضدعفونی با اتانول توصیه می‌شود. اگر تمیز کردن سطوح میز کار دشوار است، آن را با قطعه‌ای از ماده‌ای محکم که ضدعفونی آن آسان‌تر است، بپوشانید.
کار را فقط پس از اینکه تمام تجهیزات و مواد به راحتی در دسترس قرار گرفتند، شروع کنید.
تمام کارها را تا آنجا که می‌توانید به سرعت اما بدون هرگونه فشار به پایان برسانید.
ظروف باید تا حد امکان برای مدت زمان بیشتری بسته باشند.
هنگام استفاده از ظروف، تمام کارها باید نزدیک شعله Bunsen انجام شود، جایی که هوا به سمت بالا جریان می یابد.
پس از باز کردن لوله آزمایش یا بطری، گردن آن باید بلافاصله با شعله گرم شود (به زیر مراجعه کنید) در حالی که بطری را تا حد امکان به حالت افقی نگه دارید تا جریان هوا به بیرون از ظرف هدایت شود.
در حین کار با پتری دیش، از قرار گرفتن سطوح داخلی استریل در معرض آلودگی هوا جلوگیری کنید.
پیپت‌های استریل شده‌ای که در کشت‌ها یا ظروف استریل قرار می‌گیرند، نباید با مواد غیر استریل مانند لباس یا سطح فضای کار یا قسمت بیرونی لوله آزمایش/بطری تماس پیدا کنند.
هر چیزی که با میکروارگانیسم‌ها تماس پیدا می‌کند باید قبل و بعد از هر بار قرار گرفتن در معرض آن‌ها استریل شود. این کار را می‌توان توسط پرسنل فنی در آماده‌سازی و تمیز کردن بعد از یک فعالیت (برای مثال، در مورد ظروف شیشه‌ای که قرار است استفاده شود) یا توسط کارمند در حین انجام کار (برای مثال، در مورد شعله‌ور کردن حلقه سیم) انجام داد.

تکنیک‌های خاص آسپتیک

۱. استریل کردن وسایل

همیشه دست‌ها و نواحی کار خود را با اتانول ۷۰ درصد تمیز کنید. استفاده از دستکش توصیه می‌شود. این کار از تماس ذرات خارجی با نمونه‌ها در طول آزمایش جلوگیری می‌کند. در صورت استفاده نکردن از دستکش، شستن دست‌ها قبل و بعد از آزمایش الزامی است.
قبل از قرار دادن ظروف، بطری‌ها، فلاسک‌ها، پلیت‌ها و ظروف در هود کشت سلولی، قسمت بیرونی آن‌ها را با اتانول ۷۰ درصد تمیز کنید. مواد و محیط کشت را به طور مستقیم داخل فلاسک یا بطری نریزید. برای کار با مایعات از پیپت‌های شیشه‌ای استریل، پیپت‌های پلاستیکی یکبار مصرف و پیپت (pipettor) استفاده کنید و برای جلوگیری از آلودگی متقابل، از هر پیپت فقط یکبار استفاده کنید. پیپت‌های استریل شده را تا زمان استفاده باز نکنید. مطمئن شوید که پیپت‌ها را در ناحیه کار نگه دارید.
همیشه درپوش فلاسک و بطری‌ها را بعد از استفاده محکم کنید. پلیت‌های چند حفره‌ای را با نوار چسب ببندید یا در کیسه‌های قابل بازبسته قرار دهید تا از ورود آلاینده‌های هوا و میکروارگانیسم‌ها جلوگیری شود. هرگز درپوش یک فلاسک، بطری، پتری دیش و غیره استریل را تا زمانی که برای استفاده آماده نیستید، باز نکنید. هرگز آن را در معرض محیط بیرون قرار ندهید. بعد از اتمام کار، آن را دوباره بپوشانید. اگر درپوش یا درب را برداشته‌اید و نیاز به گذاشتن آن روی میز دارید، درپوش را روی سطح کار با دهانه رو به پایین قرار دهید.
فقط از ظروف شیشه‌ای و سایر وسایل استریل استفاده کنید.
هنگام انجام کارهای استریل، صحبت یا آواز خواندن نکنید.
برای کاهش خطر آلودگی، آزمایش‌ها را تا حد امکان به سرعت انجام دهید.

۲. تلقیح صفحات آگار، شیب‌دارها و کشت‌ها

کشت‌ها را تا حد امکان به سرعت با استفاده از لوله‌ها و پلیت‌هایی که برای کمترین زمان در معرض هوا قرار می‌گیرند، انتقال دهید. روش معمول این است که صفحات آگار را از بدنه خارج کنید، اما بدون اینکه درب آن را کاملاً از پایه جدا کنید.
اگر نگران هستید که درپوش پتری دیش باید برای مدت طولانی‌تر از حد معمول برداشته شود، باید نزدیک شعله Bunsen کار کنید تا احتمال آلودگی را کاهش دهید.
در صورت مشاهده آلودگی مکرر پلیت‌های خود توسط هاگ‌های قارچی، می‌توانید احتمال جریان هوا را بیشتر کاهش دهید. تلقیح پلیت‌ها را به صورت زیر انجام دهید، به طوری که سطح آگار رو به پایین باشد. به این ترتیب، احتمال کمتری وجود دارد که هاگ‌ها از طریق هوا روی پلیت قرار بگیرند.

۳. استفاده از حلقه سیم

هنگام استفاده از حلقه سیم، دسته آن را به سمت بالا نگه دارید، درست مانند نگه داشتن مداد با زاویه‌ای تقریباً عمودی. این کار انگشت را برای گرفتن درپوش یا پلاگین پنبه در لوله آزمایش یا بطری آزاد می‌گذارد. همچنین این کار تضمین می‌کند که هر گونه کشت مایع موجود در حلقه بتواند از شعله عبور کند.
قبل و بعد از استفاده حلقه‌های سیم را با داغ کردن آن‌ها تا قرمز شدن در شعله آبی پر سر و صدای Bunsen استریل کنید. این کار باعث از بین رفتن باکتری‌ها، ارگانیسم‌های آلوده کننده و هاگ‌ها می‌شود. فرآیند شعله‌ور کردن باید نوک حلقه را به آرامی گرم کند. زیرا بعد از استفاده، این حلقه مخزنی برای کشت خواهد بود که در اثر گرم شدن سریع می‌تواند سفت شود و تکه‌های کوچکی از کشت را به صورت آئروسل آزاد کند.
انتهای دسته سیم را در مخروط نور آبی شعله قرار دهید. این خنک‌ترین ناحیه آتش است. بقیه سیم را به آرامی به سمت بالا، به قسمت داغ‌تر شعله – درست بالای مخروط آبی – حرکت دهید.
آن را آنجا نگه دارید تا داغ شود. مطمئن شوید که کل عرض سیم به اندازه کافی گرما دریافت می‌کند. بگذارید چند دقیقه در هوا خنک شود و سپس بلافاصله از آن استفاده کنید. حلقه را روی زمین قرار ندهید و آن را حرکت ندهید. بعد از استفاده، باید دوباره حلقه را استریل کنید.

۴. استفاده از پیپت

از پیپت‌های استریل قطره‌ای یا مدرج (پاستور) می‌توان برای انتقال کشت‌ها یا محیط‌های کشت استریل و محلول‌ها استفاده کرد. پیپت را از انتهای بسته‌بندی/ظرف که پلاگین پنبه است، خارج کنید و مطمئن شوید که فقط به اندازه‌ای که برای نگه داشتن محکم آن لازم است، پیپت را لمس کنید. سرپیپت را فشار دهید. برای روان‌سازی، ابتدا می‌توان سرپیپت را در مایع استریل فرو برد.

بدنه پیپت را مانند خودکار نگه دارید، اما سرپیپت را فشار ندهید.انگشت کوچک شما آزاد است تا درپوش یا پلاگین پنبه را از یک بطری یا لوله آزمایش خالی بگیرد و انگشت شستتان برای مدیریت سرپیپت استفاده شود. به آرامی سرپیپت را فشار دهید و مایعی را به اندازه کافی برای نیاز خود بالا بکشید، اما بیش از حد فشار ندهید تا پلاگین پنبه خیس نشود.
فشار دادن سرپیپت پیپت قبل از قرار دادن نوک آن در مایع باعث ایجاد حباب های هوا می شود که می تواند منجر به “پاشیدن” و در نتیجه تشکیل آئروسل شود. حتماً قبل از قرار دادن نوک در مایع، سرپیپت را فشار دهید. سپس به آرامی فشار را رها کنید تا مقدار مایع مورد نظر بالا کشیده شود. سپس نوک پیپت را از مایع خارج کنید.
هر گونه مایع اضافی را برگردانید. پس از استفاده، پیپت آلوده را در یک ظرف مجاور قرار دهید تا با ضدعفونی کننده دور ریخته شود. فقط زمانی که پیپت در ظرف دور ریخته شده قرار گرفت، سرپیپت را جدا کنید، در غیر این صورت قطرات کشت می تواند منبع آلودگی برای سطح کار باشد.

۵. شعله ور کردن گردن بطری ها و لوله های آزمایش

این کار اطمینان حاصل می کند که هیچ میکروارگانیسمی وارد دهانه ظرف نشده و باعث آلودگی کشت و محیط کشت نشود. فرآیند عبور از دهانه ظرف توسط شعله، همرفت (جریان گرما) ایجاد می کند که قادر است از دهانه خارج شود و به جلوگیری از آلودگی کمک کند. قسمت داغ شعله بالای مخروط آبی رنگ قرار دارد. بطری باید در شعله حرکت داده شود و در یک مکان ثابت نباشد.
برای اطمینان از اینکه درپوش به راحتی برداشته شود، درپوش بطری را بردارید. بطری یا لوله آزمایش را با دست چپ خود بلند کنید. درپوش / پلاگین پنبه را از لوله آزمایش یا بطری با خم کردن انگشت خود به سمت کف دست چپ خود جدا کنید. (برای برداشتن درپوش، بطری را برگردانید اما نه روی درپوش). درپوش یا پلاگین پنبه را داخل درپوش یا درپوش پنبهای قرار ندهید. گردن بطری یا لوله آزمایش را با حرکت دادن گردن به سمت بالا و عقب از طریق شعله بسیار داغ Bunsen بسوزانید. پس از تکمیل فرآیند مورد نیاز، مانند خارج کردن کشت، درپوش / پلاگین پنبه را دوباره در لوله آزمایش یا بطری با انگشت خود قرار دهید. احتیاط کنید! بطری احتمالاً داغ است. (بطری را برگردانید، اما نه روی درپوش). اگر پلاگین‌های پنبه‌ای شکل اولیه خود را از دست داده باشند، می‌توان با چرخاندن ملایم دهانه ظرف در حالی که پلاگین به سمت پایین کشیده می‌شود، آنها را دوباره به سمت گردن ظرف هدایت کرد.

۶. ضدعفونی کردن سطوح

برای تکنسین‌هایی که با اتانول کار می‌کنند، به دلیل فرآیند سریع آن (حدود پنج دقیقه)، استفاده از ضدعفونی با اتانول توصیه می‌شود. تکنسین‌ها دانش بیشتری خواهند داشت و قادر به مدیریت خطرات آتش‌سوزی ناشی از کار با الکل هستند.

ابزارهای لازم برای حفظ شرایط آسپتیک

۱. چراغ بنزن (Bunsen Burner)

شاید مؤثرترین روش برای ایجاد یک میز ایمن و استریل در آزمایشگاه، استفاده از مشعل گازی ساده باشد. این قطعه تجهیزات، جریان مداومی از گاز قابل اشتعال، معمولاً گاز طبیعی (متان) را بر اساس مفهومی که حدود 150 سال پیش توسط دانشمند آلمانی رابرت ویلهلم بونسن (1811-1899) توسعه یافته است، تولید می کند.

عملکرد اصلی شعله باز استفاده شده در تکنیک‌های آسپتیک، ایجاد یک مخروط هوای داغ روی و اطراف میز به منظور محدود کردن احتمال وجود ارگانیسم‌ها در ذرات معلق گرد و غبار است. توانایی استفاده از شعله Bunsen برای گرم کردن سریع اجسام، آن را به انتخابی عالی برای استریل کردن حلقه‌های تلقیح و گرم کردن گردن شیشه‌ای بطری‌ها یا برای مشتعل کردن الکل روی پخش‌کننده‌های کشت تبدیل می‌کند.

Bunsen در برخی شرایط، مانند داخل واحد جریان هوا، که گرما می‌تواند با جریان هوا تداخل کند، مناسب نیست. به جای آن می توان از میکرو سوزاننده استفاده کرد. این یک عنصر گرمایش است که به صورت دایره‌ای شکل است. با قرار دادن حلقه تلقیح یا سوزن داخل حلقه، به سرعت حلقه یا سوزن را بخار استریل و گرم می‌کند.

میکرو سوزاننده نمی تواند مزایای آسپتیک دیگری را از Bunsen ارائه دهد.

۲. هود لامینار (Laminar Flow Unit)

کابینت‌های جریان هوای یک‌سو (یا هود) دستگاه‌های پیشرفته‌ای هستند که می‌توانند از آلودگی معرف‌ها و همچنین کشت‌های بیولوژیکی جلوگیری کنند. در صورت استفاده صحیح، می‌تواند ناحیه کاری را با هوای بسیار تمیز و پاکیزه فراهم کند. همچنین از ورود هوای اتاق به فضای کار جلوگیری می کند و آلاینده های معلق در هوا را که توسط کارکنان وارد فضای کار می شوند را نیز حذف می کند.

مهمترین جزء یک هود با جریان هوای یک‌سو، فیلتری با کارایی بالا و با قابلیت جذب باکتری است، یعنی فیلتر HEPA (هوای با بازده بالا برای ذرات معلق). یک فیلتر HEPA تایید شده باید بتواند حداقل 99.97 درصد از گرده، گرد و غبار، باکتری، کپک و هر ذره معلق در هوا با مساحتی بزرگتر از 0.3 میکرومتر را در هنگام کارکرد با سرعت 85 میلی لیتر در دقیقه حذف کند.

اولین فیلترهای HEPA در اواخر دهه 1940 توسط کمیسیون انرژی اتمی آمریکا به عنوان بخشی از پروژه منهتن (توسعه بمب اتمی) برای ارائه روشی مطمئن، موثر و کارآمد برای حذف ذرات رادیواکتیو ایجاد شدند. فیلترهای HEPA پس از جنگ جهانی دوم طبقه بندی شدند و امکان توسعه تحقیقات گسترده و کاربردهای تجاری را فراهم کردند. هودهای جریان هوای یک‌سو عناصر حیاتی بسیاری از آزمایشگاه‌های سطح ایمنی زیستی (BSL) -2 هستند و به جلوگیری از گسترش عفونت‌های ناشی از ویروس‌ها و باکتری‌ها کمک می‌کنند.

همچنین بخوانید:

مترجم: محمد صادق محمودی لرد

منبع

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه