تکنیک استخراج RNA

تکنیک استخراج RNA، خالص سازی RNA از نمونه های بیولوژیکی است. این روش با حضور فراگیر آنزیم های ریبونوکلئاز در سلول ها و بافت ها همراه بوده که می توانند به سرعت RNA را تخریب کند. روش های مختلفی در زیست شناسی مولکولی برای جداسازی RNA از نمونه ها استفاده می شود که رایج ترین آنها استخراج تیانسیانات گانیدینیوم فنل-کلروفرم است. روش لیز و شستشوی مبتنی بر کاغذ فیلتردار نیز از ظرفیت توان بالایی برای استخراج برخوردار است.

استخراج RNA در نیتروژن مایع، معمولاً با استفاده از هاون (یا دستگاههای فولادی تخصصی معروف مانند pulverizes بافت) نیز در جلوگیری از فعالیت ریبونوکلئاز مفید است.

پروتکل استخراج RNAاز سلول:

زمانی که در فلاسک حداقل 10⁶ سلول قرار داشت، محیط کشت را خارج کرده و یک بار با PBS سرد یخ (1-2 میلی لیتر) بشویید.
PBS را خارج کرده (تا حد ممکن حذف کنید) و 1 میلی لیتر محلول TRIzol اضافه کنید.
کف فلاسک را به طور کامل خراش دهید، سپس TRIzol را با یک پیپت جدا کنید و محلول TRIzol / سلول را درون یک لوله 1.5 میلی لیتری Eppendorf قرار دهید.
به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
5. 250 میکرولیتر کلروفرم را اضافه کرده و لوله را به مدت 15 ثانیه با شدت تکان دهید.
به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
سانتریفیوژ در 10،000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه.
در این مرحله، در هر لوله سه لایه وجود دارد:
لایه بالایی: شفاف، آبی
لایه میانی: DNA به شکل رسوب سفید است
لایه پایین: فاز ارگانیک صورتی
با دقت فاز آبی را با استفاده از پیپت جدا کنید. با داشتن پیپت بزرگتر، کنترل میزان و نیرو ترشح مایعات سخت تر است و این احتمال مخلوط شدن بعضی از فازهای آلی یا DNA را افزایش می دهد. مقداری از فاز آبی (حدود 1 میلی متر بالاتر از لایه DNA را برای جلوگیری از آلودگی DNA) پشت سر بگذارید. در یک لوله 1.5 میلی لیتری Eppendorf دیگر قرار دهید.
10. 550 میکرولیتر ایزوپروپانول را به فاز آبی اضافه کرده و به آرامی مخلوط کنید. به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بگذارید.
سانتریفیوژ با حداکثر سرعت (14000 دور در دقیقه) به مدت 25 دقیقه.
نمونه ها را روی یخ قرار دهید. باید گلوله ای به سختی در پایه هر لوله قابل مشاهده باشد. ایزوپروپانول را بریزید و 1 میلی لیتر اتانول 75٪ در DEPC به همراه H2O اضافه کنید. به آرامی مخلوط کنید. سانتریفیوژ در 9،500 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه.
اتانول را بریزید و بگذارید پلت بدست آمده در هوا خشک شود. این یک مرحله مهم است؛ اگر پلت بیش از حد خشک شود، RNA متبلور می شود و حل مجدد آن بسیار دشوار است. اگر به اندازه کافی از اتانول تبخیر نشود، این نیز از ورود RNA به محلول جلوگیری می کند. پس از ریختن بخش عمده ای از اتانول شستشو، تقریباً 30-40 میکرولیتر در ته لوله Eppendorf باقی خواهد ماند. برای سرعت بخشیدن به تبخیر، لوله ها را به طور خلاصه سانتریفیوژ کنید تا مایعات باقیمانده در دیواره لوله را به پایین آن حرکت کنند، سپس تا می توانید با پیپت اتانول را بکشید بدون آنکه به پلت آسیبی برسد. بهترین زمان برای اضافه کردن آب تصفیه شده یا DEPC به پلت RNA زمانی است که تنها یک هلال کوچک از محلول در اطراف پلت باقی مانده است.
تقریباً 15 تا 25 میکرولیتر (بسته به میزان نیاز) آب تصفیه شده با DEPC را به پلت RNA اضافه کنید. به یک لوله کوچکEppendorf ، RNA را به نسبت 1 به 40 (1.2 میکرولیتر در 48.8 میکرولیتر از بافر TE) رقیق کرده و به یک میکروکووت اضافه کنید. سپس میزان جذب را با سرعت 260 نانومتر اندازه گیری کنید. نسبت 280/260 باید بیشتر از 1.8 باشد. اگر کمتر از 1.5 یا 1.6 باشد،RNA احتمالاً تا حدی تخریب شده است. نسبتهای پایین تر همچنین آلودگی به DNA یا تیوسیانات را نشان می دهند.