تکنیک ایمونوسیتوشیمی ICC
تکنیک ایمونوسیتوشیمی ICC یک تکنیک آزمایشگاهی رایج است که برای تجسم آناتومیکی یک پروتئین یا آنتی ژن خاص در سلول ها با استفاده از یک آنتی بادی اولیه خاص که به آن متصل می شود، استفاده می شود.
آنتی بادی اولیه امکان تجسم پروتئین را در زیر میکروسکوپ فلورسانس در هنگام اتصال آنتی بادی ثانویه که دارای فلوروفور مزدوج است، فراهم می آورد. ICC به محققان این امکان را می دهد تا این مسئله را که آیا سلول های یک نمونه خاص آنتی ژن مورد نظر را بیان می کنند یا خیر را بررسی کنند.
بدن از انواع مختلفی از پروتئین ها، پپتیدها و آنتی ژن ها تشکیل شده است که به عملکرد سیستم ایمنی بدن کمک می کنند. آنتی ژن ها مولکول های منفردی هستند که برای تشکیل پپتیدها ترکیب می شوند. پپتیدها وقتی حاوی بیش از پنجاه اسید آمینه باشند، پروتئین نامیده می شوند. شناسایی پروتئین ها در سلول ها در شناخت پاسخ ایمنی بدن به آنتی بادی های مختلف از اهمیت برخوردار است.
از آنتی بادی ها برای مبارزه با عفونت ها در بدن استفاده می شود. ایمونوسیتوشیمی به محققان کمک می کند تا تعیین کنند که کدام پادتن ها به آنتی ژن های اختصاصی متصل شده و ایمنی را ایجاد می کنند.
مراحل انجام تکنیک ایمونوسیتوشیمی ICC
چهار مرحله اساسی برای انجام آزمایش ایمونوسیتوشیمی وجود دارد. مرحله اول کاشت سلول است که نمونه ها روی اسلایدهای شیشه ای یا صفحات شفاف قرار می گیرند. نمونه ها قبل از استفاده نیاز به زمان های مختلف انکوباسیون دارند. بعضی از نمونه ها بلافاصله استفاده می شوند در حالی که برخی دیگر باید چندین ساعت یا حتی بیست و چهار ساعت انکوبه شوند.
مرحله بعدی شامل تثبیت سلول ها و سپس رنگ آمیزی ایمنی سلول ها است. یک محلول تثبیت کننده بر روی سلول ها اعمال می شود تا در اسلاید حرکت نکند. برخی از اسلایدها همچنین باید با یک محلول دیگر قابل نفوذ باشند تا لکه بسته به نوع فیکسسیون مورد استفاده، واکنش نشان دهد سپس آنتی بادی یا رنگ ایمنی (گزارشگر) بر روی اسلاید قرار گرفته و بعداً شستشو می شود تا از حذف آنتی بادی های اضافی اطمینان حاصل شود. مرحله سوم با استفاده از میکروسکوپ تصاویر نمونه ایجاد می شود. مرحله چهارم شامل تجزیه و تحلیل تصاویر بدست آمده است.
- اضافه کردن 500 میکرولیتر از محیط کشت حاوی تقریبا 5000 سلول به چاههای یک پلیت کشت سلول.
- هنگامی که سلول ها به تراکم / سن مورد نظر رسیده اند، محیط کشت را از هر چاهک خارج کرده و دو بار با PBS بشویید.
- 300-400 میکرولیتر 2-4٪ محلول فرمالدئید را به هر چاهک اضافه کنید و به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
- چاه ها را دو بار با PBS بشویید و با 400 میکرولیتر بافر شستشو دهید. این سلول های فیکس شده را می توان در دمای 2-8 درجه سانتیگراد تا 3 ماه نگهداری و یا فوراً رنگ آمیزی کرد.
- پلیت سلولهای ثابت را دو بار در 400 میکرولیتر بافر بشویید.
- رنگ آمیزی غیر اختصاصی را با اضافه کردن 400 میکرولیتر بافر مسدود کرده و به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. بافر مسدود کردن را حذف کنید. شستشو لازم نیست.
- مطابق دستورالعمل، آنتی بادی اصلی را بدون جابجایی در بافر رقیق سازی رقیق کنید. توصیه می شود که به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- دو بار در 400 میکرولیتر از بافر شستشو دهید.
- مطابق دستورالعمل سازنده آنتی بادی ثانویه را در بافر رقیق سازی کنید. 400 میکرولیتر در چاه ها اضافه کنید و در تاریکی به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه کنید.
- دو بار در 400 میکرولیتر بافر شستشو دهید.
- 300 میکرولیتر از محلول رقیق شده DAPI را به هر چاه اضافه کنید و 2-5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. DAPI به DNA متصل می شود و یک رنگ استاندارد هسته ای مناسب است.
- یک بار با PBS و یک بار با آب بشویید.
- میکروسکوپی با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و مجموعه فیلترهای مناسب برای برچسب مورد استفاده. اسلایدها برای معاینه بعدی نیز می توانند در یک جعبه اسلاید در دمای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شوند
قیمت انجام این ازمایش
جهت استعلام قیمت و انواع جزئیات با ما تماس بگیرید