تکنیک کشت سلول های نامیرا | تکنیک های آزمایشگاه کشت سلولی

سلول های نامیرا و تکنیک کشت آن‌ها:

به خوبی ثابت شده است که سلولهای اولیه فقط می توانند تعداد مشخص از پیش تعیین شده و محدود تقسیم سلولی در محیط کشت را پشت سر بگذارند که بزرگترین ضعف آنهاست. با دو برابر شدن جمعیت، سلولهای اولیه وارد وضعیتی می شوند که دیگر نمی توانند تقسیم شوند. به این موقعیت replicative senescence می گویند که مورفولوژی سلول، بیان ژن و متابولیسم در آن دستخوش تغییر می شود. بنابراين، براي مطالعه رشد سلول، تمايز و پيري دارا بودن سلول هاي نامیرا شده در شرايط in vitro بسیار مهم است.

بررسی اجمالی سلول های نامیرا

سلولهای نامیرا شده جمعیتی از سلولهای ارگانیسم چند سلولی به دلیل جهش هستند که می توانند از پیری سلولی طبیعی فرار کرده و تقسیمات خود را ادامه دهند. بنابراین، این نوع سلول ها می توانند در دوره های طولانی مدت در شرایط آزمایشگاهی رشد کنند. جهش های مورد نیاز برای نامیراسازی می تواند به طور طبیعی اتفاق بیفتد یا عمداً برای اهداف آزمایشی ایجاد شود. رده های سلولی نامیرا ابزاری قدرتمند محققان برای تحقیقات بیوشیمی و بیولوژی سلولی موجودات چند سلولی است که نقش مهمی در مطالعه زیست شناسی رشد سلولی، تمایز و پیری دارد و آنها در تحقیقات زیست شناسی سلولی، ایمونولوژی، خون شناسی، بیولوژی سرطان، سم شناسی و زیست شناسی مولکولی به کار گرفته شده اند.

چرا ما به سلولهای نامیرا نیاز داریم؟

اولا، سلولهای اولیه پس از تقسیم محدود خود به پیری می رسند. روند استخراج دوباره ی سلول ها از بافت مورد نظر خسته کننده است و همچنین می تواند تغییرات قابل توجهی را به همراه داشته باشد. استفاده از یک سلول نامیرا می تواند پایداری مواد آزمایش را تضمین کند. ثانیا، علاوه بر ظرفیت تکثیر گسترده، سلولهای نامیرا شده ژنوتیپ و فنوتیپ مشابه یا یکسان با بافت والدین خود دارند.

معرفی یک ژن ویروسی که غلبه بر چرخه سلولی دارد

بسیاری از ژنهای ویروسی می توانند بر چرخه سلولی تأثیر بگذارند، بنابراین آنها می توانند با از بین بردن سد های بیولوژیکی که در تکثیر نقش دارند، جاودانگی را رقم بزنند. یک روش استفاده از ویروس simian virus 40 (SV40) برای القای نامیرایی است. بر اساس مطالعات انجام شده، آنتي ژن SV40 ساده ترين و مطمئن ترين عامل براي نامیراسازی بسياري از انواع مختلف سلول است. یک مثال می تواند سلول های HEK293T باشد.

پروتکل

آماده سازی سلول و ویروس
· 12-24 ساعت قبل از ترانسفکشن، سلولهای HEK293 در یک پلیت 100 میلیمتر کشت دهید تا به تراکم 60-80٪ برسد.
· 12 میکرولیتر از SV40T و 12 میکرولیتر از وکتور pCL-Ampho Retrovirus به هر پلیت اضافه کنید. محیط کشت آن را بعد از گذشت 12 ساعت عوض کرده و به آن محیط کشت کامل اضافه کنید.
انکوباسیون ویروس ها 48 تا 72 ساعت.
آلوه کردن سلول های هدف
محیط رویی ویروسی را خارج کرده و از فیلتر 0.45 عبور می دهیم.
سپس به ازای هر پلیت با تراکم 40 تا 60 درصد، 8 میلی لیتر از محلول فیلتر شده را می ریزیم.
· 12 ساعت انکوباسیون.
انتخاب سلول های نامیرا شده
پس از گذشت 72 ساعت، سلول ها را با تریپسین جدا کرده و به دو پلیت دیگر انتقال می دهیم. یک پلیت دارای آنتی بیوتیک puromycin و دیگری بدون آنتی بیوتیک.