خدمات Real-Time PCR

آزمایشگاه ژنیران با هدف خدمت به محققین، دانشجویان و همچنین کمک به سایر مراکز آماده ارائه خدمات در زمینه ی دستگاه Real-Time PCR از نمونه های مختلف با نازل ترین قیمت و بیشترین دقت و کمترین زمان می باشد. Real-Time PCR، که با نام های RT-qPCR یا qPCR نیز شناخته می شود، یکی از قدرتمندترین و حساس ترین تکنیک های آنالیز ژن است.

این تکنیک موارد استفاده گوناگونی، شامل آنالیز کمی بیان ژن، ژنوتایپینگ، اندازه گیری کپی نامبر، تایید هدف دارو، کشف بیومارکر و تشخیص پاتوژن دارد.

Realtime PCR تکثیر PCR را در حین انجام عملیات تکثیر، اندازه گیری می کند، به همین دلیل Realtime نامیده می شود و به این ترتیب می تواند غلظت قطعه مورد نظر را در شروع واکنش اندازه گیری کند. در PCR معمولی، نتایج در انتها و پس از اتمام آزمایش قابل برداشت هستند، از این رو endpoint نامیده می شوند و توانایی اندازه گیری مقدار نوکلئیک اسید در شروع واکنش را ندارند.

خدمات Real-Time PCR

🔴 زمان تحویل: دو روز کاری 🔴 نحوه محاسبه قیمت:

*هزینه تمامی مواد به عهده دانشجو می باشد

نحوه‌ی تحویل پروژه:

آزمایشگاه ژنیران بعد از تحویل نمونه های مورد آزمایش با دستگاه Real-Time PCR و انجام آنالیزهای مربوطه، نتایج Real-Time PCR را به صورت اکسل تحویل می دهد. همچنین تمامی گراف های تکثیر، گراف ذوب و نتایج آنالیز اولیه ارائه می شود. لازم به ذکر است که تمامی آزمایشات realtime PCR با استفاده از مسترمیکس های برندهای معتبر دنیا انجام می شود. آزمایشات در دستگاه Applied Biosystem StepOnePlus realtime PCR system  و در تکرارهای دو یا سه گانه انجام می شود.

خدمات جانبی:

آزمایشگاه ژنیران در حال حاضر با دارا بودن تجهیزات در زمینه های مختلف زیست شناسی سلولی-مولکولی و همچنین بخش حیوانات آزمایشگاهی علاوه بر خدمات Real-Time PCR، خدمات مربوط به آن مانند طراحی پرایمر، آنالیز آماری نتایج آزمایش ها، مشاوره طراحی و انجام آزمایش را نیز ارائه می نماید.

دانشجویان و پژوهشگران محترم می توانند پروژه خود را از سطوح in-vivo و in-vitro در آزمایشگاه ژنیران شروع کرده و RNA را از نمونه های خود استخراج کنند و غلظت نمونه های استخراجی خود را با استفاده از دستگاه نانودرآپ مورد آنالیز قرار دهند. پس از استخراج RNA با استفاده از کیت سنتز  cDNA می توانند، RNA استخراجی خود را تبدیل به cDNA کنند و در Real-Time PCR مورد استفاده قرار دهند.

برای کسب اطلاعات بیشتر از خدمات هریک از بخش های زیر، کلیک کنید:

در رابطه با دستگاه Real-Time PCR بیشتر بدانیم …

در هر واکنش Real-Time PCR، یک مولکول فلورسنت گزارشگر موجود است که تجمع محصول PCR را مانیتور می کند. پروب های TaqMan و رنگ SYBR green رایج ترین گزارشگرها هستند. همزمان با افزایش تعداد قطعات تکثیر شونده، میزان فلورسانس ساطع شده توسط گزارشگر نیز افزایش می یابد. شاخص ترین نقاط مثبت Real-Time PCR عبارتند از:

  1. تولید دیتای کمی بسیار دقیق
  2. دامنه پویای بالا در تشخیص
  3. حذف فرآیند های Post-PCR
  4. تشخیص قطعاتی که حتی یک رونوشت از آن ها در نمونه حضور دارد.
  5. دقت بسیار بالا و تشخیص کمترین مقادیر تغییر در فراوانی رونوشت ها
  6. بازدهی بالا

در PCR، تکثیر قطعات همواره مطابق الگوی زیر انجام می شود

Real-Time PCR

فاز تصاعدی(exponential)، شامل چرخه هایی است که در آن ها بازدهی تکثیر بالا و ثابت است. اگر در گرافی، لگاریتم مقدار محصول در برابر شماره سیکل رسم شود، گراف حاصل از فاز تصاعدی خطی خواهد بود. در این فاز، در هر سیکل مقدار محصول دقیقا دو برابر می شود (در چنین شرایطی گفته می شود بازدهی واکنش 100 درصد است). تکثیر تصاعدی در این فاز، به دلیل وفور و تازگی اجزای واکنش است و کینتیک واکنش، واکنش را به سمت دوبرابر شدگی محصولات در هر سیکل هدایت می کند.

فاز خطی(linear)، شامل سیکل هایی است که در آن شیب گراف تکثیر همواره رو به کاهش می شود. این فاز به دلیل آن که محصول بصورت حسابی (و نه تصاعدی) افزایش پیدا می کند، خطی نامیده می شود. همزمان با پیشرفت واکنش و مصرف مواد واکنش، بازدهی واکنش و تولید محصول کم کم کاهش پیدا می کند و مقدار محصول در هر سیکل الزاما دو برابر نمی شود.

فاز سکون(plateau)، واکنش متوقف شده و دیگر محصولی تولید نمی شود و سیگنال گزارشگر ثابت می ماند. اگر تیوب واکنش ها در شرایط واکنش بمانند، محصولات تخریب می شوند. تیوب های متفاوت در نقاط مختلفی به فاز پلاتو می رسند؛ به علت تفاوت کینتیک واکنش ها در تیوب های مختلف، در PCR معمولی، نتیجه گیری و گزارش براساس مقدار محصول در فاز پلاتو انجام می شود.

بر خلاف PCR معمولی، در Real-Time PCR بر روی فاز تصاعدی تمرکز می شود. این فاز دقیق ترین و حساس ترین گزارش برای کمی سازی داده ها را فراهم می کند. در این فاز، دستگاه های Real-Time PCR دو مقدار را اندازه گیری می کنند:

آستانه(threshold): سطحی که در آن یک واکنش به شدتی از فلورسانس که بالاتر از سیگنال پایه باشد، می رسد.

سیکل آستانه(Ct): سیکلی که در آن واکنش به آستانه می رسد. مقدار Ct در آنالیز های نسبی و مطلق مورد استفاده قرار می گیرد.

Real-Time PCR

سیکل آستانه(Ct):

آنالیز دیتای Real-Time PCR بر اصل سیکل آستانه استوار است؛ سیکلی که در آن مقدار سیگنال فلورسنت حاصل از تجمع محصولات PCR از مقدار آستانه عبور می کند.

نمونه هایی که تعداد رونوشت های الگوی تکثیر در آن ها بیشتر است، در سیکل های پایین تری نسبت به نمونه هایی که رونوشت های هدف کمتری دارند، به آستانه می رسد. از این جهت، مقدار Ct به 2 فاکتور وابسته است:

  • فراوانی رونوشت هدف در شروع واکنش
  • بازدهی تکثیر در PCR

سایبر گرین

رنگ SYBR™ Green رایج ترین رنگ مورد استفاده در Real-Time PCR است. این رنگ، با اتصال به DNA دورشته ای تولید شده در PCR، تولید و تجمع محصول را ردیابی می کند. مکانیزم عمل این رنگ به شرح زیر است:

  • سایبر گرین وقتی به dsDNA متصل می شود، عملکرد فلورسنتی خود را اعمال می کند.
  • در طی PCR و با عملکرد آنزیم Taq DNA Polymerase، رونوشت هدف تکثیر می شود.

با پیشرفت واکنش، مقدار بیشتری محصول تولید می شود. SYBR™ Green به تمام dsDNA های تولید شده متصل می شود و در نتیجه شدت سیگنال فلورسانس متناسب با مقدار محصولات تولید شده افزایش می یابد.

Real-Time PCR

آنالیز دیتای بیان ژن Real-time PCR

روش های کمی سازی نسبی بیان ژن امکان محاسبه کمی اختلاف بیان یک ژن در نمونه های مختلف را فراهم می کند. دیتای خروجی بصورت Fold-change گزارش می شود. به عنوان مثال، می توان مقدار تفاوت در بیان یک ژن را در زمان های مختلف در نمونه های مداخله شده و مداخله نشده، با این روش محاسبه کرد. روش Ct مقایسه ای(ΔΔCt) رایج ترین روش آنالیز دیتای Realtime PCR است. در این روش، ابتدا با محاسبه ΔCt، Ct نرمال می شود:

ΔCt= Ct/target-Ct/reference

که در این رابطه، Target، ژن هدف و مورد مطالعه، و Reference ژن کنترل داخلی می باشد.

سپس برای محاسبه مقدار تغییرات بیان ژن، ابتدا ΔΔCt محاسبه می شود:

ΔΔCt/case= ΔCt/case -ΔCt/control

در این رابطه Case، نمونه هدف و مورد مطالعه و Control، نمونه کنترل عمومی آزمایش است.

و نهایتا مقدار FC از طریق رابطه زیر محاسبه می گردد:

FC=2– ΔΔCt

نتایج چنین آزمایشی، عموما در یک پلات میله ای، به شکل زیر نشان داده می شود.

Real-Time PCR

🔵کاربرد های Real-Time PCR (ریل تایم پی سی آر)🔵

  • آنالیز بیان ژن نمونه های یوکاریوتی و پروکاریوتی

    با استفاده از تکنیک Real-Time PCR می توان بیان ژن های یوکاریوتی و پروکاریوتی تمامی ارگانیسم های توالی یابی شده را بررسی نمود. به منظور آنالیز بیان ژن های یوکاریوتی و پروکاریوتی در ابتدا بایستی از نمونه های مورد نظر استخراج RNA انجام داد و سپس RNA استخراج شده را به cDNA تبدیل نمود و طبق اصول Real Time PCR بیان ژن های یوکاریوتی و پروکاریوتی را اندازه گیری نمود.

  • ژنوتایپینگ snp ها و جهش ها

    به تغییرات و تنوع های توالی طبیعی با دانسیته ی بالا در ژنوم ها، چندشکلی های تک نوکلئوتیدی یا Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) گفته می شود. از SNP ها به عنوان مارکر ژنتیکی به منظور بررسی تغییر فنوتیپی درون یک گونه استفاده می شود. با استفاده از روش های بیولوژیکی میتوان ژنوتایپینگ انجام داد.

    از جمله استراتژی های مهم به منظور ژنوتایپینگ می توان به استراتژی تبعیض آللی یا Allele Discrimination Strategies و روشهای شناسایی آلل یا Allele Detection Methods اشاره نمود.

    استراتژی Allele Discrimination به مجموعه روش های مبتنی بر واکنش های بیوشیمیایی اختصاصی آلل گفته می شود و به چهار روش می توان Allele Discrimination انجام داد که عبارتند از:

    1- روش توسعه ی پرایمری یا Primer extension

    2- هیبریداسیون یا Hybridization

    3- روش اتصال یا Ligation

    4- شکاف آنزیمی یا Enzymatic cleavage

    روش های Allele Detection به طرق مختلفی انجام می شود که می توان به تشخیص بر مبنای Mass-spect، تشخیص مبتنی بر سیگنال فلورسانس و کمی لومینسانس اشاره کرد.

  • MSI

    تکنیک MSI یا آزمایش ناپایداری توالی های  microsatellite یا MSI به جهش در ژن های Mismatch repair یا MMR یا تغییراتی همچون متیلاسیون در این ژن ها اطلاق می شود که جهش در ژن های MMR می تواند سبب کاهش پروتئین های MMR و در نهایت ایجاد ناپایداری توالی ها یا microsatellite (MSI) می شود.

    از جمله کاربردهای تست MSI می توان به شناسایی بیماران مبتلا به سندرم لینچ، تصمیم گیری در مورد انجام شیمی درمانی ادجوانت در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال مرحله دو و همچنین آگاهی در مورد پاسخ به ایمونوتراپی در بیمارن مبتلا به سرطان متاستاتیک اشاره نمود.

  • HRM

    از جمله روش های جدید برای شناسایی جهش ها و یا پلی مورفیسم ها می توان به تکنیک HRM (High Resolution Melting) اشاره نمود. زمانی که بخواهید تمامی جهش ها در تعداد زیادی نمونه را بررسی کنید، بایستی تمامی نمونه ها توالی یابی شوند اما انجام توالی یابی هزینه های بالایی دارد و همراه با خطا هست لذا برای رفع این مشکلات می توان از تکنیک HRM استفاده نمود.

    در تکنیک HRM افراد مورد آزمون براساس ژنوتیپشان گروه بندی می شوند سپس از هر گروه یا هر هاپلوتایپ چند نفر انتخاب و مورد توالی یابی قرار می گیرند که باعث می شود تمامی افراد مورد توالی یابی قرار نگیرند و تعداد نمونه ها و متعاقبا هزینه و خطای کار کاهش می یابد.

    با استفاده از تکنیک HRM می توان جهش های جدید در توالی مورد بررسی شناسایی نمود، می توان وقوع جهش در توالی مورد بررسی را نسبت به توالی رفرنس شناسایی نمود. نقاط متیلاسیون در توالی مورد بررسی را می توان شناسایی نمود و همچنین می توان ترسیم درخت فیلوژنتیک و ارزیابی تکاملی انجام داد.

    شناسایی نقاط متیله در توالی مورد نظر نسبت به توالی مرجع

    گروه بندی افراد بر حسب ژنوتیپ یک توالی مورد نظر

    تعیین کلاد افراد و ترسیم درخت های فیلوژنتیکی و خوشه بندی جمعیت های مختلف

  • ارزیابی وضعیت متیلاسیون DNA

    متیلاسیون DNA یا DNA methylation به بازهای متیله شده ی طبیعی DNA اشاره دارد که روش های بسیاری برای بررسی متیلاسیون DNA وجود دارد که اکثرا مبتنی بر طراحی پرایمر و PCR می باشند.

    از جمله روش های ارزیابی وضعیت متیلاسیون DNA می توان به Bisulfate Sequencing PCR (BSP، روش MSP، روش Methylight BSP، روش Nested BSP، روش CORBRA، روش Methylight MSP، روش Nested MSP، روش SNuPE و روش Bisulfite pyrosequencing اشاره نمود.

  • اندازه گیری طول تلومر

    طبق نتایج مطالعات دانشمندان،  اندازه گیری طول تلومر می تواند نقش قابل توجهی در روش درمان بیماران مبتلا به نارسایی های مرتبط با مغز استخوان داشته باشد. تلومرها از انتهاهای DNA محافظت می کنند و با افزایش سن فرد اندازه ی تلومرها کوتاهتر می شوند که این امر منجر به بیماری های خاصی می شود که از جمله ی آنها می توان به بیماری فیبروز ریوی و نارسایی های مغز استخوان، بیماری آمفیزم، بیماری های مختلف کبدی، سندرم میلودیسپلاستیک و دیگر سرطان ها اشاره نمود.

    از جمله روش های اندازه گیری طول تلومر می توان به تست flow-FISH اشاره نمود که مخفف fluorescent in-situ hybridization می باشد. یکی دیگر از روش های اندازه گیری طول تلومر می توان به استفاده از ابزار qPCR اشاره نمود. در این روش از سلولهای نمونه ی خونی DNA استخراج می شود و میزان توالی های تکراری DNA اندازه گیری می شود. هزینه ی آزمایش qPCR کمتر از تست flow-FISH می باشد.

  • اندازه کانت میتوکندری

    تغییر در کانت میتوکندری می تواند منجر به بیماری های خاصی شود. موتاسیون در ژن های میتوکندریایی می تواند منجر به شرایطی شود که در سلول انرژی به اندازه ی کافی و نرمال تولید نمی شود.

    جهش هایی این چنینی  علائمی در اندام هایی که مصرف انرژی بالایی دارند ایجاد می کند که از جمله ی این اندام ها می توان به کبد، پانکراس، چشم و کلیه ها اشاره نمود. از جمله روش های اندازه گیری کانت میتوکندریایی می توان به ابزار Real Time PCR اشاره نمود که با استفاده از ژن normalize کننده به صورت دقیق کانت میتوکندریایی اندازه گیری می شود.

22 دیدگاه در “خدمات Real-Time PCR”

  1. کاربر ژنیران میگوید:

    با سلام
    ميخواستم هزينه هاي مربوط به استخراج RNA از نمونه سلولي، سنتز CDNA و انجام RT-PCR رو بپرسم؟

    پاسخ
  2. کاربر ژنیران میگوید:

    تعرفه هر ران ریل تایم چقدر هست؟و آیا قیمت ران معمولی با اچ آر ام متفاوت است یا خیر

    پاسخ
  3. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام . برای setup pcr tera armsپروتکل دستگاه و وواکنش ها به چه صورت باید باشد . با گرادیان دمای انیلینگ را به دست اوردم ولی وقتی pcrمیشود فقط باند خارجی و باند موتانت داریم و باند طبیعی ندارم

    پاسخ
    • Farbod Esfandi میگوید:

      سلام! برای تنظیم PCR با استفاده از روش T-ARMS (Tetra-primer Amplification Refractory Mutation System)، ابتدا مهم است که تمام جنبه‌های پروتکل، از جمله طراحی پرایمرها، شرایط واکنش، و دمای انیلینگ به درستی انجام شود. اگر شما در حال مواجهه با مشکل در دیدن باند طبیعی هستید، ممکن است مسائلی در طراحی پرایمرها یا شرایط PCR وجود داشته باشد. در اینجا چند نکته برای تنظیم PCR T-ARMS ارائه می‌دهم:

      1. طراحی پرایمر:
      اطمینان حاصل کنید که پرایمرها برای تشخیص موتاسیون مورد نظر به درستی طراحی شده‌اند. در روش T-ARMS، چهار پرایمر استفاده می‌شود: دو پرایمر خارجی که یک باند کنترل تولید می‌کنند و دو پرایمر داخلی که برای تشخیص الل‌های موتانت و وحشی طراحی شده‌اند.
      پرایمرهای داخلی باید به گونه‌ای طراحی شوند که در ناحیه موتاسیون با DNA تطابق داشته باشند و فقط در صورت وجود توالی متناظر با آنها، محصول PCR تولید شود.
      2. شرایط PCR:
      دمای انیلینگ: از گرادیان دمای انیلینگ برای تعیین بهترین دمای انیلینگ برای پرایمرهای خود استفاده کرده‌اید. اطمینان حاصل کنید که دمای انتخاب شده بهینه است. برای تست دمای انیلینگ، معمولاً دماهایی از حداقل تا حداکثر پیشنهادی برای پرایمرها بررسی می‌شود.
      ترکیب واکنش: اطمینان حاصل کنید که تمام مواد مورد نیاز برای واکنش PCR، مانند dNTPها، بافر، MgCl2، و تمپلیت DNA، در غلظت‌های مناسب وجود دارند.
      3. بررسی و عیب‌یابی:
      کیفیت DNA تمپلیت: اطمینان حاصل کنید که DNA تمپلیت شما از کیفیت بالایی برخوردار است و به اندازه کافی تمیز است.
      بازبینی پرایمرها: اگر مشکلی در تولید باند طبیعی وجود دارد، ممکن است لازم باشد طراحی پرایمرهای داخلی را مجدداً بررسی کنید یا آن‌ها را دوباره سنتز کنید.

      پاسخ
  4. کاربر ژنیران میگوید:

    باسلام
    ببخشید هزینه طراحی پروب و انجام واکنش taqman چقدر است؟

    پاسخ
  5. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام. قیمت خدمات از جداسازی آر ان آ تا انجام ریل تایم پی سی آر رو برای ۴ تا گروه میخواهم بدانم

    پاسخ
    • Admin میگوید:

      سلام دوست عزیز لطفا جهت اطلاع یافتن از خدمات و قیمت ها با آزمایشگاه تماس بگیرید.

      پاسخ
  6. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام انسیه کرد هستم از دانشگاه علوم پزشکی بابل، برای شش ژن و سه تریت ریکشن ریل تایم پی سی آر میخواستم قیمت را بفرمایید

    پاسخ
    • Admin میگوید:

      سلام لطفا جهت کسب اطلاع درباره قیمت های خدمات با آزمایشگاه تماس بگیرید.

      پاسخ
  7. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام
    هزینه pcr با الگوی dna به منظور تکثیر ژن چقدره؟
    همچنین هزینه خالص سازی ژن از طریق ژل ریکاوری و توالی یابی قطعه رو بهم بگید لطفا

    پاسخ
  8. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام وقت بخیر هزینه آزمایش PCR برای دانشجوی ارشد رو ممنون میشم لطف کنین .

    پاسخ
    • Admin میگوید:

      سلام دوست عزیز
      جهتت کسب اطلاعات بیشتر با ژنیران تماس بگیرید.

      پاسخ
  9. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام وقتتون بخیر بنده هزینه تست real time pcr رو می خواهم دانشجو ارشد بیوتکنولوژی هستم برای پروپوزال می خوام هیچ جا حدود قیمت رو نمیبینم برای پیش فاکتور های پروپوزال خدمات شما به چه صورت است؟

    پاسخ
  10. کاربر ژنیران میگوید:

    با سلام و وقت بخیر، من دانشجوی فردوسی مشهد هستم و ۴۰ نمونه دارم؛ میخواستم نحوه ارسال به آزمایشگاه شما و هزینه Realtime PCP برای این نمونه ها را سوال کنم
    خیلی ممنون

    پاسخ
  11. فاطمه احمدی میگوید:

    سلام. من دانشجوی گرگان هستم. میخاستم نحوه ارسال نمونه به تهران و هزینه هر بار ران کردن نمونه ریل تایم بپرسم. من سایبر گرین یکتا تجهیز دارم.

    پاسخ
    • Admin میگوید:

      سلام بستگی به نوع و تعداد نمونه دارد. لطفا با ازمایشگاه تماس بگیرید یا شماره بلفن بگذارید

      پاسخ

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *