رادیوایمونواسی (RIA): تعریف، اساس، روش، نتایج، موارد استفاده

فهرست مطالب نمایش

رادیوایمونواسی چیست؟

رادیوایمونواسی یکی از تکنیک‌های ایمونواسی حساس است که با استفاده از ایزوتوپ‌های رادیویی به تعیین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی در نمونه کمک می‌کند.

این یک نوع برهم‌کنش آنتی‌ژن – آنتی‌بادی در شرایط آزمایشگاهی است.

هنگامی که از رادیوایزوتوپ‌ها به جای آنزیم‌ها به عنوان لیبل برای کونژوگه شدن با آنتی‌ژن‌ها یا آنتی‌بادی‌ها استفاده می‌شود، تکنیک تشخیص کمپلکس آنتی‌ژن – آنتی‌بادی رادیوامونواسی (RIA) نامیده می‌شود. رادیوایمونواسی (RIA) یک روش آزمایشگاهی است که حضور یک آنتی‌ژن را با حساسیت بسیار بالا اندازه گیری می‌کند.

RIA اولین بار در سال 1960 برای اندازه گیری انسولین پلاسما توسط Solomon Berson و Rosalyn Yalow از بیمارستان Veterans Administration در نیویورک استفاده شد.

روش‌های کلاسیک RIA بر اساس اصل اتصال رقابتی است. در این روش، یک آنتی‌ژن نشان‌دار نشده با یک آنتی‌ژن نشان‌دار رادیویی برای اتصال به آنتی‌بادی با ویژگی مناسب رقابت می‌کند؛ بنابراین، هنگامی که مخلوطی از آنتی‌ژن نشان‌دار شده و بدون نشان‌دار با آنتی‌بادی مربوطه انکوبه می‌شوند، مقدار آنتی‌ژن نشان‌دار رادیویی آزاد (که به آنتی‌بادی متصل نیست) مستقیماً با مقدار آنتی‌ژن نشان‌دار نشده در مخلوط متناسب است.

موارد مورد نیاز در رادیوایمونواسی (RIA)

آنتی‌ژن‌های نشان‌دار شده رادیویی: آنتی‌ژن‌ها به طور کلی با ایزوتوپ‌های ساطع کننده اشعه گاما مانند
I-125 و ایزوتوپ‌های ساطع کننده اشعه بتا مانند تریتیوم نشان‌دار می‌شوند. به آنها آنتی‌ژن داغ (hot antigens) نیز می‌گویند.
آنتی‌بادی‌های اختصاصی: به مقادیر کمتری نسبت به آنتی‌ژن‌ها مورد نیاز هستند.
آنتی‌ژن‌های بدون لیبل (آنتی‌ژن‌های نمونه): به آنها آنتی‌ژن سرد (cold antigens) نیز می‌گویند.
صفحات میکروتیتر: پلیت میکروتیتر 96 چاهکی
محلول‌های بافر شستشو: از بافر شستشو مانند تری فلورواستیک اسید 1% استفاده می‌شود.

اساس رادیوایمونواسی (RIA)

آنتی‌ژن‌ها و آنتی‌بادی‌ها به طور خاص برای تشکیل کمپلکس Ag-Ab متصل می‌شوند. آنتی‌ژن را می‌توان با رادیوایزوتوپ‌ها نشان‌دار یا کونژوگه کرد. آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده از نمونه با آنتی‌ژن‌های نشان‌دار رادیویی برای اتصال به پاراتوپ های آنتی‌بادی‌های خاص رقابت می‌کنند. آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده جایگزین آنتی‌ژن‌های نشان‌دار شده‌ای می‌شوند که از قبل با آنتی‌بادی‌ها مرتبط هستند.

آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده هنگامی که با آنتی‌بادی‌ها متصل می‌شوند، مقدار آنتی‌ژن‌های نشان‌دار رادیویی آزاد را در محلول افزایش می‌دهند. از این رو غلظت آنتی‌ژن‌های نشان‌دار آزاد به طور مستقیم با آنتی‌ژن‌های بدون لیبل محدود شده متناسب است.

این فرایند شامل ترکیبی از سه اصل است:

یک واکنش ایمنی یعنی اتصال آنتی‌ژن و آنتی‌بادی.
یک واکنش رقابتی اتصال یا جابه‌جایی رقابتی. (عامل اختصاصی بودن فرایند)
اندازه گیری انتشار رادیویی (عامل حساسیت فرایند)

واکنش ایمنی

هنگامی که یک ماده بیولوژیکی خارجی از طریق یک مسیر غیرخوراکی وارد جریان خون بدن می‌شود، بدن مواد شیمیایی خاص موجود در سطح ماده خارجی را به عنوان آنتی‌ژن می‌شناسد و آنتی‌بادی‌های خاصی را علیه آنتی‌ژن تولید می‌کند تا اثرات آن را از بین ببرد و بدن را ایمن نگه دارد. آنتی‌بادی‌ها توسط سیستم ایمنی بدن تولید می‌شوند، بنابراین، این یک واکنش ایمنی است. در اینجا آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌ها به دلیل تأثیرات شیمیایی به هم متصل می‌شوند و حرکت می‌کنند. این امر با اصل الکتروفورز که در آن پروتئین‌ها به دلیل بارگیری جدا می‌شوند متفاوت است.

واکنش رقابتی اتصال یا جابه‌جایی رقابتی

این پدیده‌ای است که در آن وقتی دو آنتی‌ژن وجود دارد که می‌توانند به یک آنتی‌بادی متصل شوند، آنتی‌ژن با غلظت بیشتر به طور گسترده با آنتی‌بادی محدود که جایگزین آنتی‌بادی‌های دیگر می‌شود، متصل می‌شود؛ بنابراین در اینجا در آزمایش، یک آنتی‌ژن نشان‌دار رادیویی مجاز است به یک آنتی‌بادی با میل ترکیبی بالا متصل شود. سپس هنگامی که سرم بیمار به آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده اضافه می‌شود، شروع به اتصال به آنتی‌بادی می‌کند و آنتی‌ژن نشان‌دار شده را جایگزین می‌کند.

اندازه گیری انتشار رادیویی

پس از پایان انکوباسیون، شستشوها برای حذف هر گونه آنتی‌ژن غیرمتصل انجام می‌شود. سپس انتشار رادیویی مجموعه آنتی‌ژن – آنتی‌بادی به کمک اشعه گاما از آنتی‌ژن نشان‌دار شده رادیویی اندازه گیری می‌شود.

آنتی‌ژن هدف به صورت رادیواکتیو لیبل گذاری می‌شود و به آنتی‌بادی‌های خاص خود متصل می‌شود (مقدار محدود و شناخته شده‌ای از آنتی‌بادی خاص باید اضافه شود). یک نمونه، به‌عنوان‌مثال در سرم خون، به منظور شروع واکنش رقابتی آنتی‌ژن‌های نشان‌دار شده و آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده از نمونه سرم، آنتی‌بادی‌های خاص اضافه می‌شوند. رقابت برای آنتی‌بادی‌ها مقدار مشخصی از آنتی‌ژن نشان‌دار را آزاد می‌کند. این مقدار متناسب با نسبت آنتی‌ژن نشان‌دار شده به یک آنتی‌ژن نشان‌دار نشده است.

سپس می‌توان یک منحنی اتصال ایجاد کرد که اجازه می‌دهد مقداری آنتی‌ژن در سرم بیمار استخراج شود. این بدان معناست که با افزایش غلظت آنتی‌ژن نشان‌دار نشده، مقدار بیشتری از آن به آنتی‌بادی متصل می‌شود و جایگزین نوع نشان‌دار شده می‌شود. سپس آنتی‌ژن‌های متصل از آنتی‌ژن‌های غیرمتصل جدا می‌شوند و رادیواکتیویته آنتی‌ژن‌های آزاد باقی مانده در مایع رویی اندازه گیری می‌شود.

کمپلکس‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی یا با اتصال عرضی با یک آنتی‌بادی دوم یا با افزودن معرف‌هایی که رسوب کمپلکس‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی را افزایش می‌دهند، رسوب می‌کنند. شمارش رادیواکتیویته در رسوبات امکان تعیین مقدار آنتی‌ژن نشان‌دار شده رادیویی رسوب شده با آنتی‌بادی را فراهم می‌کند. یک منحنی استاندارد با ترسیم درصد آنتی‌ژن نشان‌دار شده رادیویی متصل به آنتی‌بادی در برابر غلظت‌های شناخته‌شده یک آنتی‌ژن بدون لیبل استاندارد شده ساخته می‌شود و غلظت آنتی‌ژن در نمونه‌های بیمار از آن منحنی برون‌یابی می‌شود.

حساسیت بسیار بالای RIA مزیت اصلی آن است.

روش رادیوایمونواسی (RIA)

آنتی‌بادی‌های خاص با غلظت شناخته شده در چاه میکروتیتر فیکس می‌شوند.
سپس مقدار مشخصی از آنتی‌ژن‌های داغ به چاه اضافه می‌شود.
سپس به دقت شسته می‌شوند تا هر گونه آنتی‌ژن متصل نشده از بین برود
در این مرحله، رادیواکتیویته چاه در حداکثر مقدار ممکن خواهد بود.
سپس آنتی‌ژن‌های بدون لیبل به چاه اضافه می‌شوند.
آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده به آنتی‌بادی‌ها متصل می‌شوند و آنتی‌ژن‌های نشان‌دار آزاد در چاه وجود خواهند داشت.
سپس دوباره با دقت شسته می‌شوند تا آنتی‌ژن‌های نشان‌دار آزاد حذف شوند.
سپس رادیواکتیویته چاهک‌ها توسط گاما شمار، اندازه گیری می‌شود.

تفسیر نتایج رادیوایمونواسی (RIA)

در ابتدا، آنتی‌ژن‌های نشان‌دار شده به آنتی‌بادی‌ها متصل می‌شوند، بنابراین رادیواکتیویته حداکثر خواهد بود.

اگر نمونه حاوی آنتی‌ژن‌های خاص مورد نظر باشد، به آنتی‌بادی‌ها متصل می‌شود و آنتی‌ژن‌های نشان‌دار شده را آزاد می‌کند و در نتیجه رادیواکتیویته محلول کاهش می‌یابد.

بنابراین، با مشاهده کاهش رادیواکتیویته می‌توان تأیید کرد که آنتی‌ژن مورد نظر در نمونه وجود دارد و اگر رادیواکتیویته ثابت بماند، می‌توان آن را آزمایش منفی نامید.

با افزایش غلظت آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده، رادیواکتیویته کاهش می‌یابد. با رسم نموداری از رادیواکتیویته (بر حسب درصد) در مقابل غلظت آنتی‌ژن‌های نشان‌دار نشده، یک منحنی استاندارد به دست می‌آید.

نمونه مورد سنجش به موازات یک روش مشابه اجرا می‌شود و رادیواکتیویته اندازه گیری شده با منحنی استاندارد برای تعیین غلظت آنتی‌ژن کالیبره می‌شود.