رنگ آمیزی اسید فست: اصول، روش، تفسیر و مثال‌ها

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی اسید فست

رنگ آمیزی اسید فست یکی از تکنیک‌های رنگ آمیزی افتراقی است که ابتدا توسط Ziehl توسعه یافت و بعداً توسط Neelsen اصلاح شد. از این رو این روش را تکنیک رنگ آمیزی Ziehl-Neelsen نیز می‌نامند. Neelsen در سال 1883 از کربول فوشین (Carbol-fuchsin) و حرارت مربوط به روش Ziehl استفاده و سپس با یک الکل اسیدی رنگ زدایی کرد و در نهایت با متیلن بلو (Methylene blue) رنگ آمیزی را انجام داد. به این ترتیب تکنیک رنگ آمیزی Ziehl-Neelsen توسعه یافت.

هدف اصلی از این رنگ آمیزی، افتراق باکتری‌ها به گروه‌های اسید فست و غیر اسید فست می‌باشد.

این روش برای میکروارگانیسم‌هایی استفاده می‌شود که با روش‌های رنگ آمیزی ساده یا گرم (Gram staining)، رنگ آمیزی نمی‌شوند، به ویژه اعضای متعلق به جنس مایکوباکتریوم (Mycobacterium) که مقاوم بوده و تنها با رنگ آمیزی اسید فست قابل مشاهده هستند.

اصول رنگ آمیزی اسید فست

هنگامی که اسمیر با کربول فوشین رنگ آمیزی می‌شود، مواد لیپوئیدی (Lipoidal) موجود در دیواره سلولی مایکوباکتری را حل می‌کند، اما با اعمال گرما، کربول فوشین بیشتر به دیواره لیپوئیدی نفوذ کرده و وارد سیتوپلاسم می‌شود. بعد از همه این فرایندها، سلول‌ها به رنگ قرمز ظاهر می‌شوند. سپس اسمیر با یک عامل رنگ‌زدا (HCL 3% در الکل 95%)، بی‌رنگ می‌شود، اما سلول‌های اسید فست به دلیل وجود مقدار زیادی ماده لیپوییدی در دیواره سلولی خود مقاوم هستند و مانع از نفوذ محلول رنگ‌زدا می‌شوند.

ارگانیسم‌های غیر اسید فست فاقد مواد لیپویدی در دیواره سلولی خود هستند و به همین دلیل به راحتی رنگ‌زدایی انجام شده و سلول‌ها بی‌رنگ می‌شوند. سپس اسمیر با رنگ ثانویه متیلن بلو رنگ آمیزی می‌شود. فقط سلول‌های رنگ‌زدایی شده رنگ ثانویه را جذب می‌کنند و رنگ آن را می‌گیرند و به رنگ آبی ظاهر می‌شوند، در حالی که سلول‌های اسید فست رنگ قرمز را حفظ می‌کنند.

خلاصه‌ای از روش رنگ آمیزی اسید فست

کاربرد	شناساگر	رنگ سلولی
کاربرد	شناساگر	اسید فست	غیر اسید فست
رنگ اولیه	فوشین کربول	قرمز	قرمز
رنگ‌زدا	الکل اسیدی	قرمز	بی‌رنگ
رنگ آمیزی ثانویه	متیلن بلو	قرمز	آبی

روش رنگ آمیزی اسید فست

با استفاده از یک تکنیک استریل، اسمیر باکتریایی را روی یک لام تمیز و بدون چربی آماده کنید.
اجازه دهید اسمیر در هوا خشک شود و سپس حرارت داده تا تثبیت شود.

تثبیت الکل: زمانی توصیه می‌شود که اسمیر از خلط سینه تحت رنگ‌زدایی با هیپوکلریت سدیم (Sodium hypochlorite) (به عنوان بی‌رنگ کننده) تهیه نشده باشد و بلافاصله رنگ آمیزی نشده باشد. M. tuberculosis توسط سفید‌کننده و در طی فرآیند رنگ آمیزی از بین می‌رود. تثبیت حرارتی خلط سینه که با هیپوکلریت سدیم رنگ‌زدایی نشده، M. tuberculosis را از بین نمی‌برد در حالی که تثبیت الکل باکتری‌کش است.

اسمیر را با رنگ کربول فوشین بپوشانید.
رنگ را تا زمانی که بخار شروع به بلند شدن کند (یعنی حدود 60 درجه سانتی‌گراد) حرارت دهید. بیش از حد حرارت ندهید. اجازه دهید رنگ گرم شده به مدت 5 دقیقه روی لام باقی بماند.

حرارت دادن رنگ: هنگام گرم کردن فوشین کربول باید دقت زیادی کرد، به خصوص اگر رنگ آمیزی روی سینی یا ظرف دیگری انجام می‌شود که در آن مواد شیمیایی بسیار قابل اشتعال از رنگ آمیزی قبلی جمع شده است. فقط باید یک شعله کوچک با استفاده از یک سواب مشتعل که قبلاً به چند قطره الکل اسیدی یا اتانول 70 درصد (حجمی/حجمی (v/v)) یا متانول آغشته شده است، در زیر اسلایدها اعمال شود. از یک سواب بزرگ آغشته به اتانول استفاده نکنید زیرا خطر آتش‌سوزی وجود دارد.

رنگ را با آب تمیز بشویید.

توجه: هنگامی که آب لوله کشی تمیز نیست، اسمیر را با آب فیلتر شده یا آب تمیز و جوشیده شده، بشویید.

اسمیر را به مدت 5 دقیقه با الکل اسیدی 3 درصد حجمی/حجمی بپوشانید یا تا زمانی که اسمیر به اندازه کافی بی‌رنگ (یعنی صورتی کم‌رنگ) شود.

احتیاط: الکل اسیدی قابل اشتعال است، بنابراین با احتیاط و به دور از شعله آتش از آن استفاده کنید.

با آب تمیز، خوب بشویید.
اسمیر را با رنگ مالاشیت گرین (Malachite green) به مدت 1 تا 2 دقیقه بپوشانید. اگر اسمیر نازک است زمان طولانی‌تری صرف این کار کنید.
رنگ را با آب تمیز بشویید.
پشت لام را تمیز کنید و آن را در یک قفسه آبکشی قرار دهید تا اسمیر در هوا خشک شود (با استفاده از یک ماده جاذب آن را خشک نکنید).
اسمیر را به صورت میکروسکوپی با استفاده از روغن ایمرسیون (Oil immersion) و میكروسكوپ‌ نوری با لنز X100 بررسی کنید.

تفسیر رنگ آمیزی اسید فست

اسید فست: قرمز روشن تا بنفش پررنگ (B)، ارگانیسم‌های میله‌ای قرمز صاف یا کمی انحنادار که به صورت منفرد یا در گروه‌های کوچک ظاهر می‌شوند و ممکن است به صورت رشته‌ای به نظر برسند.
غیر اسید فست: رنگ آبی (A)

نمونه‌هایی از رنگ آمیزی اسید فست

تصویر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با استفاده از روش رنگ آمیزی اسید فست

اسید فست: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (Mycobacterium tuberculosis)، مایکوباکتریوم اسمگماتیس (Mycobacterium smegmatis).
باکتری غیر مایکوباکتریایی: نوکاردیا (Nocardia)
انگل کوکسیدین (Coccidian): کریپتوسپوریدیوم (Cryptosporidium)

همچنین بخوانید: