رنگ‌ آمیزی سلول‌ ها با رنگ‌ های هوچست Hoechst و DAPI

رنگ‌ آمیزی سلول‌ ها با رنگ‌ های هوچست Hoechst و DAPI: هرآنچه که باید بدانید

Hoechst و DAPI رنگ‌های فلورسنت آبی محبوب و مخصوص هسته هستند که می‌توانند برای رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده یا فیکس شده استفاده شوند. هر دوی این رنگ‌ها، رنگ‌های متصل به شیارهای مینور DNA هستند که ترجیحاً بیشتر به مناطق غنی از A/T  نسبت به مناطق غنی از G/C در DNA متصل می‌شوند. رنگ‌ها دارای حداقل فلورسانس در محلول هستند، اما پس از اتصال به DNA به‌شدت فلورسنت می‌شوند؛ بنابراین می‌توان از آنها برای رنگ‌آمیزی سلول‌ها بدون مرحله شستشو استفاده کرد.

رنگ‌آمیزی بسیار پایدار است و رنگ‌ها در بیشتر انواع سلولی سمیت کمی دارند. Hoechst و DAPI در آب با غلظت 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر بسیار پایدار هستند و می‌توان آن‌ها را در دمای 4 درجه سانتی‌گراد برای سال‌ها نگهداری کرد تا زمانی که دور از نور نگهداری شوند. بااین‌حال، تفاوت‌های قابل‌توجهی بین DAPI و Hoechst وجود دارد که باید مورد توجه قرار گیرد.

 Hoechst برای رنگ‌آمیزی سلول زنده ترجیح داده می‌شود

رنگ‌های Hoechst عموماً برای رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده (نسبت به DAPI) ترجیح داده می‌شوند زیرا سمیت کمتر و نفوذ سلولی بیشتری دارند.  Hoechst 33342 و Hoechst 33258 ، رنگ‌های با ساختار مشابهی هستند که به طور گسترده در مطالعات چرخه سلولی و برای رنگ‌آمیزی هسته‌ای برای سلول‌های زنده یا تثبیت شده استفاده می‌شوند. Hoechst 33528 نسبت به Hoechst 33342 کمی بیشتر محلول در آب است و نفوذ سلولی کمتری دارد.

برخی گزارشات مبنی بر این است که Hoechst 33342 باعث آپوپتوز می‌شود یا سمیت بیشتری را در برخی از انواع سلولی نشان می‌دهد. همچنین گزارش‌هایی وجود دارد که به تفاوت در کمیت رنگ‌آمیزی آنها در برخی از انواع سلولی اشاره می‌کند. هر دو رنگ هوچست معمولاً برای رنگ‌آمیزی با غلظت  1 ug/m استفاده می‌شوند. هنگام کار با هوچست، نگهداری محلول‌های رقیق این رنگ چندان توصیه نمی‌شود، زیرا رنگ به ‌مرور زمان در اثر رسوب یا جذب در ظرف از بین می‌رود.

DAPI برای رنگ‌آمیزی سلول فیکس شده ترجیح داده می‌شود

DAPI نسبت به رنگ‌های Hoechst، نسبت به غشای سلولی قدرت نفوذ کمتری دارد و سمی‌تر است و بنابراین برای رنگ‌آمیزی سلول تثبیت شده نسبت به رنگ‌آمیزی سلول زنده ترجیح داده می‌شود. در صورت رنگ‌آمیزی سلول تثبیت شده، میزان غلظت DAPI  در حد 1ug/mL توصیه می‌کنیم، البته برای رنگ‌آمیزی سلول زنده با DAPI، می‌توان از غلظت‌های بالاتر (معمولاً ug/mL10) استفاده کرد. DAPI در محلول‌های رقیق پایدار است و می‌تواند برای استفاده طولانی‌مدت وبا خاصیت ضد محو شدن مستقیماً اضافه شود.

رنگ‌آمیزی باکتری یا مخمر

Hoechst و DAPI باکتری‌ها را تیره‌تر از سلول‌های پستانداران رنگ می‌کنند. باکتری‌های زنده یا کشته شده (گرم منفی یا گرم مثبت) را می‌توان با 12-15ug/mL Hoechst یا DAPI در PBS یا 150 میلی‌مولار NaCl به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق رنگ‌آمیزی کرد. سلول‌های مرده بیشتر از سلول‌های زنده رنگ می‌گیرند. در S. cerevisiae، DAPI و Hoechst ترجیحاً سلول‌های مرده را با تعیین موقعیت و محل‌یابی هسته‌ای و سیتوپلاسمی رنگ‌آمیزی می‌کنند. در مخمر زنده، هوچست رنگ‌آمیزی هسته‌ای و سیتوپلاسمی کم‌رنگی را نشان می‌دهد، درحالی‌که DAPI رنگ‌آمیزی میتوکندریایی کم‌رنگ را نشان می‌دهد. رنگ‌ها را می‌توان برای رنگ‌آمیزی مخمر با غلظت 12-15ug/mL در PBS استفاده کرد.

تبدیل نوری/تصویری با DAPI و  Hoechst

یک مسئله کمتر آشنا در حیطه DAPI و Hoechst، تبدیل نوری توسط نور UV است که باعث فلورسانس رنگ‌ها در کانال‌های دیگر می‌شود. برخی از استراتژی‌ها برای جلوگیری از این امر شامل تصویربرداری از فلورسانس سبز قبل از تغییر به کانال DAPI، یا حرکت به یک میدان دید بدون نور قبل از تصویربرداری از کانال سبز پس از قرارگرفتن نمونه در معرض UV است (رابرتز، 2019). استفاده از محیط‌های کشت سخت و تثبیت شده مانند EverBrite™ Hardset به‌جای محیط مرطوب مبتنی بر گلیسرول می‌تواند تبدیل نوری را کاهش دهد.

پروتکل‌های رنگ‌آمیزی Hoechst و DAPI

ملاحظات برای رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده

برای رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده، مورفولوژی یا تداوم حیات برخی از انواع سلول‌ها ممکن است تحت‌تأثیر تبادل محیطی قرار گیرد. علاوه بر این، سلول‌های مرده شناور ممکن است در طول حذف محیط از بین بروند و سلول‌های سوسپانسیون باید با سانتریفیوژ جمع‌آوری شوند تا محیط تبادل شود.

افزودن مستقیم محلول رنگ 10X یک روش رنگ‌آمیزی مناسب است که نیاز به تعویض محیط کشت ​​ندارد، اما باید دقت شود که فوراً و درعین‌حال به‌آرامی مخلوط شود تا از غلظت بالای رنگ ناپایدار یا ازهم‌گسیختگی سلول‌ها توسط پیپت جلوگیری شود. توجه داشته باشید که اضافه‌کردن رنگ با غلظت بالا را مستقیماً به سلول‌های کشت توصیه نمی‌کنیم، زیرا این امر منجر به ایجاد مناطقی با قرارگرفتن در معرض رنگ بالا می‌شود.

نحوه رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده

رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده با تبادل محیط کشت

رنگ را به محیط کشت کامل اضافه کنید. توصیه می‌کنیم از رنگ‌های Hoechst با غلظت 1ug/mL یا DAPI با غلظت  10 ug/mL استفاده کنید.

توجه: DAPI یا Hoechst را می‌توان با سایر پروب‌های فلورسنت ترکیب کرد.

محیط کشت را از سلول‌ها جدا کرده و با محیط حاوی رنگ جایگزین کنید.

سلول‌ها را در دمای اتاق یا 37 درجه سانتیگراد به مدت 5-15 دقیقه انکوبه کنید، سپس تصویربرداری کنید.

نکته: برای رنگ‌آمیزی خاص شستشو لازم نیست ولی لکه هسته‌ای بعد از شستشو پایدار است.

رنگ‌آمیزی سلول‌های زنده با افزودن مستقیم پروب 10X

رقت میانی رنگ را در محیط کشت کامل با 10 برابر غلظت نهایی رنگ‌آمیزی توصیه شده تهیه کنید. توصیه می‌کنیم رنگ‌های Hoechst را تا  10 ug/mL رقیق کنید یا DAPI را تا  100 ug/mL رقیق کنید.

توجه: DAPI یا Hoechst را می‌توان با سایر پروب‌های فلورسنت ترکیب کرد.

بدون حذف محیط از سلول‌ها، یک‌دهم حجم رنگ 10X را مستقیماً به چاهک اضافه کنید.

بلافاصله با پیپت کردن محیط به بالا و پایین، کاملاً مخلوط کنید. برای اندازه‌های بزرگ‌تر چاهک، می‌توان ظرف را به‌آرامی چرخاند تا مخلوط شود.

سلول‌ها را در دمای اتاق یا 37 درجه سانتیگراد به مدت 5-15 دقیقه انکوبه کنید، سپس تصویربرداری کنید.

نکته: برای رنگ‌آمیزی خاص شستشو لازم نیست ولی لکه هسته‌ای بعد از شستشو پایدار است.

نحوه رنگ‌آمیزی سلول‌های ثابت یا بخش‌هایی از بافت

رنگ را به PBS اضافه کنید. ما غلظت نهایی  1 ug/mL را توصیه می‌کنیم.

توجه: DAPI یا Hoechst را می‌توان با آنتی‌بادی‌ها یا سایر پروب‌ها ترکیب کرد. رنگ‌ها را نیز می‌توان به در صورت امکان در بافر با مواد شوینده یا بلاک‌کننده رقیق کرد.

PBS را با رنگ به سلول‌ها یا بخش‌های بافت اضافه کنید و در دمای اتاق، حداقل 5 دقیقه انکوبه کنید.

نمونه‌ها را به تصویر بکشید. شستشو اختیاری است اما لازم نیست. نمونه‌ها را می‌توان بلافاصله تصویربرداری کرد یا در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد.

توجه: DAPI را می‌توان مستقیماً در محیط کشت ضد محو برای نصب و رنگ‌آمیزی یک‌مرحله‌ای قرار داد. هنگام استفاده از این رنگ در محیط کشت، ممکن است زمان‌های انکوباسیون طولانی‌تری لازم باشد تا رنگ به طور کامل به هسته‌های سلول نفوذ کند.

جهت مطالعه بیشتر تکنیک‌های آزمایشگاهی کلیک کنید

منبع

مترجم: مریم محجوب