تکنیک ها, میکروبیولوژی, ویدیو های آموزشی
آموزش رنگ آمیزی گرم
رنگ آمیزی گرم :
رنگ‌آمیزی گرم یکی از حیاتی‌ترین تکنیک‌های رنگ‌آمیزی در میکروبیولوژی است. اسم خود را از یک میکروبیولوژیست دانمارکی به نام هانس کریستین گرم گرفته است و اولین بار درسال 1882 معرفی شد. اساسا به دلیل شناسایی ارگانیسم‌های مسبب ایجاد پنومونیا، ابداع شد. در اولین آزمایش انجام شده، اغلب رنگ‌آمیزی گرم شامل استفاده از‌کریستال ویولت یا متیلن بلو به عنوان رنگ‌های اولیه بود.
طریقه این رنگ‌آمیزی بر پایه نگه‌داشتن رنگ اولیه توسط ارگانیسم است. اگر به طور بنفش-آبی در زیر میکروسکوپ دیده شوند، ارگانیسم‌های گرم مثبت نامیده می‌شوند و اگر توسط رنگ‌های پایه در زیر میکروسکوپ،به صورت قرمز دیده شوند، ارگانیسم گرم منفی نامیده می‌شوند.
اولین قدم برای رنگ آمیزی گرم، استفاده از‌رنگ کریستال ویولت برای رنگ‌آمیزی اولیه لام‌ها است. قدم بعدی، که تثبیت نامیده می‌شود، شامل استفاده از ید موجود در مجموعه کریستال ویولت-ید برای جلوگیری از حذف آسان رنگ است. متعاقبا، یک رنگ‌بر، که اغلب حلالی مانند اتانول یا استون است، برای پاک‌کردن رنگ استفاده می‌شود. اصول اولیه رنگ‌آمیزی گرم، شامل توانایی دیواره سلولی باکتری برای حفظ رنگ کریستال ویولت در زمان تیمار با حلال می‌باشد.گرم مثبت‌ها، محتوا پپتیدوگلیکان بالا دارند، برخلاف‌گرم منفی‌ها که محتوا مایع بیشتری دارند.
در ابتدا، همه باکتری‌ها رنگ کریستال ویولت را می‌گیرند، اما با استفاده از حلال، لایه مایع از ارگانیسم‌های گرم منفی شسته نمی‌شود. با حل نشدن لایه مایع، گرم منفی‌ها رنگ اولیه خود را از دست می‌دهند. در مقابل، حلال، دیواره سلولی گرم مثبت را با مسدود‌کردن منافذ، کم‌آب می‌کند و از انتشار کمپلکس ید-کریستال ویولت جلوگیری کرده و در نتیجه، باکتری‌ها رنگ شده باقی می‌مانند. طول مرحله رنگ‌زدایی، یک قدم حیاتی در رنگ‌آمیزی گرم است. چرا‌که قرار‌گیری طولانی مدت در معرض یک رنگ‌زدا می‌تواند همه‌ی لکه‌ها را از هر دو نوع باکتری پاک کند.
قدم نهایی در رنگ‌آمیزی‌گرم این است که از رنگ پایه فوشین برای رنگ‌زدایی رنگ صورتی باکتری گرم منفی، به مظور شناسایی راحت‌تر باکتری استفاده کرد. این ماده همچنین به عنوان لکهبر شناخته می‌شود. بعضی از آزمایشگاه‌ها از سافارین به عنوان لکهبر استفاده می‌کنند، با این حال، ارگانیسم‌های گرم منفی رنگ شده با فوشین پایه، شدید‌تر از سافارین رنگ‌زدایی می‌شوند.
باکتری های زنده تقریبا بی‌رنگ هستند و تضاد کافی با محیط معلق در آن را ندارند. به همین دلیل به سختی در زیر میکروسکوپ قابل رویت میکردند. در اثر رنگ آمیزی بین میکروارگانیسم و محیط اطراف آن ها تضاد رنگی حاصل می شود و باکتری ها بهتر مشاهده می شوند. در این روش میکروب را به وسیله حرارت کشته و سپس رنگ می کنند و با میکروسکوپ بررسی می نمایند.
استفاده از رنگ یکی از اصلی ترین روش ها جهت تشخیص میکروارگانیسم ها محسوب می گردد. مواد رنگی اغلب املاحی هستند که یکی از یون های آن ها رنگی است. این املاح ترکیبی از یک یون با بار الکتریکی مثبت و یک یون با بار الکتریکی منفی است. در واقع تفاوت بار الکتریکی موجب گرایش ماده رنگی به سلول باکتری می شود.
رنگ از یک حلقه بنزنی که یک گروه شیمیایی به نام کروموفور به آن متصل است و مجموعا کروموژن نامیده می شود، تشکیل شده و یک گروه شیمیایی به نام اگزوکروکروم دارد که خاصیت یونیزاسیون به بخش کروموژن داده و آن را قادر می سازد تا به صورت نمک یا به حالت ترکیب در آید. توانایی یک رنگ در پیوند با ترکیبات سلولی از قبیل پروتئین ها یا اسید های نوکلئیک وابسته به بار الکتریکی بخش کروموژن می باشد و از این نظر رنگ ها را به سه دسته تقسیم می کنند:
1- رنگ های بازی: رنگ های بازی کاتیونیک هستند یعنی بعد از یونیزه شدن قسمت رنگزای آن بار مثبت نشان می دهد، لذا تمایل زیادی به رنگ کردن ترکیبات سلولی با بار منفی دارند. اسید های نوکلئیک، ترکیبات سلولی با بار منفی هستند که به راحتی با رنگ های بازی مانند متیلن بلو باند می شوند.
2- رنگ های اسیدی: رنگ های اسیدی آنیونیک هستند؛ یعنی بعد از یونیزه شدن قسمت رنگ زای آن بار منفی نشان می دهند، لذا تمایل زیادی به رنگ کردن ترکیبات سلولی با بار مثبت دارند. پروتئین ها، ترکیبات سلولی با بار مثبت هستند که به راحتی با رنگ های اسیدی مانند اسید پیکریک باند می شوند.
3- رنگ های خنثی: رنگ های خنثی به رنگ هایی اطلاق می شود که کروکوژن آن فاقد بار الکتریکی است و ترکیبات بدون بار سلول همانند چربی ها مانند سودان سیاه را رنگ می کند.
تکنیک های متعدد رنگ آمیزی وجود دارد که یکی از عمده ترین روش ها جهت مشاهده، تمایز و جداسازی باکتری ها از یکدیگر محسوب می گردد که به صورت طرحی در زیر نشان داده شده است. در رنگ آمیزی ساده مانند رنگ آمیزی با متیلن بلو، کلیه قسمت های نمونه یکسان رنگ می شوند و برای مشاهده شکل، اندازه و شمارش میکروب ها به کار می رود. در ررنگ آمیزی افتراقی مانند رنگ امیزی گرم، با استفاده از اختلاف هایی که در ساختمان میکروارگانیسم ها وجود دارد می توان آن ها را از یکدیگر تشخیص داد.
در رنگ آمیزی اختصاصی مانند رنگ آمیزی دانه های متاکروماتیک، فقط گروهی از میکروارگانیسم ها با این روش رنگ خواهند شد و به این ترتیب یک روش شناسایی محسوب می شود. یک ویژگی مهم در باکتری ها برای طبقه بندی آن ها پاسخ نسبت به رنگ آمیزی گرم می باشد. واکنش نسبت به رنگ آمیزی گرم به تعداد زیادی از ویژگی های مورفولوژیک باکتری هایی که از لحاظ تکاملی با هم ارتباط دارند بستگی دارد. تکنیک رنگ آمیزی گرم با استفاده از یک رنگ قلیایی (کریستال ویوله) آغاز می شود.
سپس یک محلول تثبیت کننده استفاده می شود و تمام باکتری ها در این مرحله از رنگ آمیزی بنفش می شوند. سپس باکتری ها با الکل شسته می شوند که در این مرحله باکتری ها گرم مثبت مجموعه رنگ ویوله را نگه می دارند و بنفش باقی می مانند ولی باکتری های گرم منفی کاملا به وسیله الکل بی رنگ می شوند. این مکانیسم به علت این که الکل حلال چربی است و اثر آن بر دیواره سلولی باکتری ها ایجاد منافذی را می نماید، می باشد.
در باکتری های گرم مثبت به علت ضخامت کم چربی منافذ کوچکی ایجاد شده و با دهیدراته شدن پروتئین ها مسدود می شوند ولی در باکتری های گرم منفی در اثر افزودن الکل بر دیواره دارای چربی زیاد منافذ ایجاد شده زیاد می باشند و در نتیجه سبب خروج رنگ بنفش از باکتری و بی رنگ شدن آن می گردد. آخرین مرحله رنگ آمیزی گرم افزودن یک رنگ متضاد مانند سافرانین می باشد که سبب جذب رنگ صورتی قرمز سافرانین در باکتری های گرم منفی بی رنگ شده می شود و باکتری های گرم مثبت همچنان بنفش باقی می مانند.
من برا دوره آموزش رنگ آمیزی گرم مراجعه کردم و مشاورین خیلی خوب راهنماییم کردن و ثبتنامم رو جدیدا انجام دادم تشکر از مشاورین آگاه آزمایشگاه.