رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور (GMS): اصول، روش و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی GMS

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور نوعی تکنیک رنگ آمیزی خاص است که در میکروبیولوژی و بافت شناسی برای مشاهده قارچها، به ویژه آنهایی که‌ هاگ‌های مشخصی به نام آرتروکونیدیا را تشکیل می‌دهند، استفاده می‌شود.

این تکنیک رنگ آمیزی در دهه 1930 توسط Grocott و Gomori توسعه یافت و بر اساس استفاده از نقره و متنامین است. سلول‌های قارچی با محلول نیترات نقره رنگ آمیزی می‌شوند که سپس با افزودن متنامین یک الگوی سیاه رنگ مشخص ایجاد می‌شود که سلول‌های قارچ را به راحتی در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده می‌کند.

اهمیت رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور در توانایی آن در تجسم خاص موجودات قارچی نهفته است که دیدن آن با استفاده از سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی دشوار است. این موضوع به ویژه در تشخیص عفونت‌های قارچی مفید است چرا که شناسایی ارگانیسم عاملی حیاتی برای درمان موثر است.

تاریخچه رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور ریشه در توسعه میکروبیولوژی و بافت شناسی به عنوان رشته‌های علمی دارد و یکی از نوآوری‌های موجود در تکنیک‌های رنگ آمیزی است که به پیشرفت درک ما از میکروارگانیسم‌ها کمک کرده است. امروزه تکنیک رنگ آمیزی به طور گسترده در محیط‌های بالینی و تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرد و ابزار مهمی برای تشخیص و مطالعه عفونت‌های قارچی است.

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

گوموری متنامین سیلور (GMS) اغلب برای شناسایی کربوهیدرات‌ها در میکروارگانیسم‌های قارچی استفاده می‌شود.
رنگ آمیزی György Gömöri که به نام پزشک مجارستانی پیشگام این تکنیک نامگذاری شده است، اکنون به طور گسترده استفاده می‌شود.
اولین بار برای تشخیص پنوموسیستیس جیرووسی، قارچی که باعث پنوموسیتوز می‌شود و در افراد دارای نقص ایمنی و سرکوب سیستم ایمنی یافت می‌شود، استفاده شد، اما هدف اصلی آن ارزیابی بافت‌ها و اختلالات از دست رفته در کبد و رکتوم بود (Nadworny، Wang، Tredget، & Robert. ، 2010).
گوموری نسبت به سایر رنگ آمیزی‌ها مانند رنگ آمیزی اسید-شیف و رنگ آمیزی Gridley حساسیت بیشتری به شناسایی قارچ‌ها و سایر میکروارگانیسم‌های غنی از پلی ساکارید در مراحل آماده شده با پارافین دارد.
با استفاده از این تکنیک در بافت شناسی، قارچ در آسپیره‌ها، بافت‌ها و اسمیرها به راحتی قابل تشخیص و نمایش است.

هدف استفاده از تکنیک رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

برای اثبات وجود قارچ در یک نمونه.
اثبات وجود Pneumocystis jirovecii و Histoplasma spp.

اصول رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

اکسیداسیون اسید کرومیک، آلدئیدها را از اجزای پلی ساکارید دیواره سلولی قارچ تولید می‌کند که با کاهش کمپلکس قلیایی هگزامین-نقره همراه است. این واکنش مشابه واکنش پریودیک اسید شیف است (به PAS مراجعه کنید).

محلول قلیایی هگزامین-نقره گروکوت حاملی است که پس از احیا، یون‌های نقره را رسوب می‌دهد و در نتیجه محل را تیره می‌کند که اصطلاحا “واکنش آرجنتافین” نامیده می‌شود.

واکنش آرجنتافین – توانایی یک محلول پیچیده نقره برای سیاه شدن بافت- اصطلاحی است که برای تکنیک‌های متعددی (مثلاً von Kossa) به کار می‌رود. بنابراین، اصطلاح “واکنش argentaffin” نباید به عنوان یک اسم خاص استفاده شود و به نوعی صفت است.

در اکثر کشورهای توسعه یافته، عفونت‌های قارچی که در افراد دارای نقص ایمنی ظاهر می‌شوند، در حال افزایش است. قارچ‌ها با هماتوکسیلین به خوبی رنگ نمی‌شوند و به دلیل وجود کربوهیدرات در دیواره سلولی خود PAS مثبت هستند.

مراقبتهای مهم

باید از یک بخش کنترل مثبت شناخته شده برای اطمینان از تمایز مناسب استفاده شود.
آماده سازی معرف‌ها نیاز به حرارت دارد.
حجم اسید کرومیک را با استفاده از تکنیک مایکروویو اندازه‌گیری کنید.
هنگام استفاده از محلول‌های مایکروویو، مطمئن شوید که درب‌ها محکم بسته نشده باشند تا امکان انبساط فراهم شود.
قبل از قرار دادن اسلایدها در محلول‌های رنگ آمیزی گرم شده با مایکروویو، اطمینان حاصل کنید که محلول‌ها کاملاً مخلوط شده‌اند تا توزیع دمایی یکنواخت را ایجاد کنند.
توجه داشته باشید که محلول‌های خارج شده از مایکروویو ممکن است خود به خود بجوشند.
زمان ممکن است بر اساس نوع و قدرت مایکروویو متفاوت باشد.
ترکیبی از روش اصلی و روش مایکروویو ممکن است استفاده شود. برای مثال، روش مایکروویو برای نقره ممکن است با روش اصلی برای اسید کرومیک ترکیب شود، یا بالعکس.

معرف‌های مورد نیاز

محلول تری اکسید کروم، محلول بی سولفیت سدیم، محلول نیترات نقره، محلول متنامین، محلول بوراکس، محلول کلرید طلا، محلول تیوسولفات سدیم، استوک لایت گرین.

آماده سازی محلول

کیت‌های آماده روشی استاندارد برای این معرف‌ها هستند، در حالی که برخی از محلول‌ها به صورت آماده برای استفاده در دسترس هستند. نحوه آماده سازی محلول‌ها به غلظت‌های رنگی مورد استفاده بستگی دارد.

کرومیک اسید (1.4%): برای تهیه اسید کرومیک (1.4%)، به 4 گرم تری اکسید کروم و 100 میلی لیتر آب مقطر نیاز دارید.
نقره: نیترات نقره 5 درصد در بطری 23 میلی لیتری با 3 درصد متانامین/هگزامین 1.25 میلی لیتر با 5 درصد بوراکس آب مقطر (3 میلی لیتر) و آب لوله‌کشی (25 میلی لیتر).
کلرواورات سدیم 3.2 درصد (کلرید طلای زرد): کلرید طلا (کلروآئورات سدیم یا «کلرید طلای زرد»)، 3.2 درصد 1.0 گرم + 500 میلی لیتر H2O خالص سازی شده.
سولفات سدیم4.2 % (Hypo) : 2 گرم سولفات سدیم به اضافه 100 میلی لیتر آب مقطر
محلول استوک لایت گرین: 10 میلی لیتر از لایت گرین را در 40 میلی لیتر اسید استیک حل کنید تا استوک به دست آید.
محلول نقره: 23 میلی لیتر از متانامین (هگزامین) 3% ، نیترات نقره5% 1.25 میلی لیتر، بوراکس 5% (تترابورات سدیم) 3 میلی لیتر، آب مقطر 25 میلی لیتر.

روش رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

روش عمومی

ابتدا اسلایدها را در آب مقطر فرو ببرید.
سپس با اسید کرومیک آبی 4 درصد به مدت 1 ساعت در دمای اتاق اکسید کنید.
به مدت کوتاه آبکشی کنید.
برش‌های بافت را به مدت یک دقیقه در متا بی‌سولفیت سدیم 1% خیس کنید.
زمان شستشوی توصیه شده سه دقیقه زیر فشار ملایم آب است.
آن را با آب خالص بشویید.
به مدت 15 تا 20 دقیقه یا تا زمانی که به رنگ قهوه‌ای درآید، در محلول نقره که از قبل تا دمای 60 درجه سانتیگراد گرم شده است، خیس کنید (بعد از شستشو در آب مقطر، قارچ‌ها باید قهوه‌ای تیره باشند).
شستشوی کامل با آب مقطر انجام دهید.
در تونال کلرید طلا 0.2٪ به مدت 2 دقیقه قرار دهید.
با آب خالص بشویید.
در تيوسولفات سديم 2% به مدت 2 دقيقه انکوبه کنيد.
به مدت 5 دقیقه با شیر آب بشویید.
استفاده از رنگ گرین لایت 15 ثانیه
از الکل به صورت مالشی استفاده کنید تا آثار باقی مانده از رنگ گرین لایت را از لام پاک کنید.
رطوبت را حذف و لام را تمیز کنید.

روش مایکروویو

ابتدا قطعات را در آب مقطر فرو کنید.
اسلایدها را باید در یک شیشه کوپلین پلاستیکی با 40 میلی لیتر اسید کرومیک 4 درصد آب و درب آن کمی باز باشد.
در مایکروویو 150 وات در حدود 2 دقیقه قرار دهید.
اسلایدها را در ظرف کوپلین فرو کنید و بگذارید دو دقیقه دیگر بماند.
با آب و صابون به مدت 30 ثانیه بشویید.
به مدت 30 ثانیه، قطعات را در متا بی‌سولفیت سدیم 1٪ خیس کنید.
زیر شیر آب به مدت 30 ثانیه بشویید.
محلول نقره را (در یک شیشه کوپلین پلاستیکی با درب شل) به مدت 60 ثانیه با قدرت 450 وات گرم کنید.
برای قرار دادن اسلایدها در محلول داغ نقره، مرحله هشتم این است که ابتدا آنها را در آب مقطر بشویید.
در مایکروویو 150 وات 30 ثانیه قرار دهید.
با شیب به سمت بالا و پایین تکان دهید. پس از آن، با آب مقطر بشویید و قبل از بررسی زیر میکروسکوپ اجازه دهید برای یک دقیقه بیشتر بماند (گاهی به هم بزنید و بالا و پایین ببرید).
رنگ قارچ‌ها باید قهوه‌ای تیره باشد، بنابراین اگر لام‌ها به اندازه کافی رنگ‌دار نشدند، آنها را دوباره در محلول نقره قرار دهید و هر دقیقه آنها را بررسی کنید.
در تونال کلرید طلا 0.2٪ 1 دقیقه قرار دهید.
برای شستشو از آب مقطر استفاده کنید.
اسلایدها را به مدت 1 دقیقه در تیوسولفات سدیم 2% قرار دهید.
زیر شیر آب به مدت 15 ثانیه بشویید.
استفاده از رنگ گرین لایت به مدت 15 ثانیه.
لام را از رنگ گرین لایت باقیمانده با شستشوی با الکل پاک کنید.
رطوبت را حذف کنید.

نتایج رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

رنگ سیاه برای Pneumocystis jirevoci و Histoplasma spp دیده می‌شود.
میسلیوم‌ها و هیف‌ها در داخل بدن رنگ صورتی مایل به قرمز به خود می‌گیرند.
برای انگل‌های تک یاخته‌ای توکسوپلاسما و لیشمانیا منفی است
لکه‌های موسین خاکستری
سبز روشن به پس زمینه نفوذ کرده و لکه سبز کم رنگی به جا می‌گذارد.

قارچ، پنوموسیستیس کارنی، هیستوپلاسما	سیاه
قسمت‌های داخلی میسلیوم‌ها و هیف‌ها	صورتی مایل به قرمز
لیشمانیا ، توکسوپلاسما	رنگ آمیزی منفی
موسین	خاکستری تیره
پس زمینه	سبز کم رنگ

با توجه به فرآیند کاهش محلول نیترات نقره، گونه‌های قارچ سیاه رنگ می‌شوند. پس از احیا، محلول نیترات نقره یون‌های نقره سیاه رنگ تولید می‌کند که سلول‌های قارچ را سیاه می‌کند.

به دلیل تبدیل نیترات نقره به یون نقره، میسلیوم و هیف قارچ به رنگ صورتی مایل به قرمز رنگ می‌گیرد، در حالی که موسین به رنگ خاکستری تیره می‌شود. استفاده از گرین لایت باعث می‌شود پس زمینه سبز مایل به آبی به نظر برسد.

موارد احتیاط

از روپوش آزمایشگاهی، عینک و دستکش استفاده کنید. محلول‌های داغ بدون درپوش را در هود لامینار نگه دارید. از هر گونه مواد شیمیایی یا رنگی دوری کنید.
کرومیک اسید برای پوست و غشاهای مخاطی بسیار خورنده، برای کلیه‌ها بسیار سمی و بسیار سرطانزا است.
مصرف سولفیت سدیم می‌تواند منجر به درد معده و تحریک پذیری شود، بنابراین بهتر است از آن اجتناب کنید. برای چشم‌ها، پوست و سایر غشاهای مخاطی نیز تحریک کننده است.
پوست و چشم‌ها ممکن است توسط نیترات نقره تحریک شوند.
اکسید کننده یک ماده تومورزا است که در صورت مصرف می‌تواند باعث درد شدید معده شود و سرطان زا است.
مصرف تیوسولفات سدیم سمی است و می‌تواند منجر به التهاب دستگاه گوارش، پوست، چشم‌ها و سیستم تنفسی شود.
در موارد خاص، قرار گرفتن در معرض لایت گرین با سرطان مرتبط است.

کاربردهای رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

تشخیص عفونت قارچی: رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور برای تشخیص عفونت‌های قارچی، به ویژه عفونت‌های ناشی از قارچ‌های تشکیل دهنده آرتروکونیدیا، با تجسم خاص ارگانیسم‌های قارچی در نمونه‌های بافتی استفاده می‌شود.
پاتولوژی: از این تکنیک رنگ آمیزی در معاینات پاتولوژیک نمونه‌های بافتی برای شناسایی عفونت‌های قارچی استفاده می‌شود که برای تشخیص و درمان بیماری مهم است.
تحقیقات میکروبی: تکنیک رنگ آمیزی در تحقیقات میکروبی به ویژه در مطالعه عفونت‌های قارچی و تأثیر آنها بر سلامت انسان و محیط زیست نیز استفاده می‌شود.
قارچ شناسی پزشکی: رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور یک ابزار مفید در قارچ شناسی پزشکی، مطالعه قارچ‌ها و تأثیر آنها بر سلامت انسان است، زیرا به شناسایی و تشخیص عفونت‌های قارچی در بیماران کمک می‌کند.
پایش محیطی: تکنیک رنگ آمیزی را می‌توان در پایش محیطی برای تشخیص وجود ‌هاگ‌های قارچ در نمونه‌های هوا، آب و خاک استفاده کرد که برای درک شیوع عفونت‌های قارچی و کنترل تأثیر آن بر سلامت انسان مهم است.
کنترل کیفیت در داروها: در کنترل کیفیت محصولات دارویی استفاده می‌شود تا اطمینان حاصل شود که آنها عاری از آلودگی قارچی هستند که می‌تواند تأثیرات منفی بر اثربخشی و ایمنی آنها داشته باشد.
ایمنی مواد غذایی: از این تکنیک رنگ آمیزی می‌توان در ایمنی مواد غذایی نیز برای تشخیص وجود ‌هاگ قارچ در محصولات غذایی استفاده کرد که می‌تواند باعث فساد شود و برای مصرف کنندگان خطراتی برای سلامتی ایجاد کند.
کشاورزی: رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور در کشاورزی برای مطالعه تأثیر عفونت‌های قارچی بر محصولات و توسعه استراتژی‌های کنترل گسترش و تأثیرشان استفاده می‌شود.

مزایای رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

اختصاصیت: این تکنیک رنگ آمیزی بسیار اختصاصی است و فقط موجودات قارچی را رنگ آمیزی می‌کند که آن را به ابزاری موثر برای تشخیص عفونت‌های قارچی تبدیل می‌کند.
حساسیت بالا: رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور قادر است حتی سطوح پایینی از ارگانیسم‌های قارچی را شناسایی کند که آن را به ابزاری مفید برای تشخیص زودهنگام عفونت‌های قارچی تبدیل می‌کند.
تکنیک آسان: انجام این تکنیک رنگ آمیزی نسبتاً ساده است و به تجهیزات پیچیده یا مهارت خاصی نیاز ندارد و این امر باعث می‌شود که در دسترس باشند.
مقرون به صرفه: در مقایسه با سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی اختصاصی، رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور نسبتاً ارزان است و نیازی به تجهیزات تخصصی ندارد و آن را به گزینه‌ای مقرون به صرفه برای بسیاری از آزمایشگاه‌ها تبدیل می‌کند.

محدودیت‌های رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور

محدود به قارچ‌ها: تکنیک رنگ آمیزی فقط برای رنگ آمیزی موجودات قارچی موثر است و برای تجسم انواع دیگر میکروارگانیسم‌ها مفید نیست.
منفی کاذب: در برخی موارد، تکنیک رنگ آمیزی ممکن است منفی کاذب ایجاد کند، به ویژه اگر موجودات قارچی در تعداد کم وجود داشته باشند یا اگر توسط سایر اجزای بافت پوشانده شده باشند.
موارد مثبت کاذب: در موارد نادر، تکنیک رنگ آمیزی ممکن است نتایج مثبت کاذب ایجاد کند که در آن ساختارهای غیر قارچی به اشتباه به عنوان موجودات قارچی شناسایی می‌شوند.
نمونه محدود: رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور معمولاً فقط بر روی نمونه‌های بافت پارافین تثبیت شده با فرمالین استفاده می‌شود و برای استفاده در انواع دیگر نمونه‌ها مناسب نیست.
کشنده: تحریکات پوستی و معده می‌تواند ناشی از استنشاق مواد شیمیایی باشد. نشان داده شده است که خود معرف‌ها باعث سرطان می‌شوند.

سوالات متداول

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

یک تکنیک رنگ آمیزی بافت‌شناسی است که برای شناسایی و تجسم ارگانیسم‌های قارچی در نمونه‌های بافتی استفاده می‌شود.

چه نوع نمونه‌هایی را می‌توان با رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور رنگ آمیزی کرد؟

این روش رنگ آمیزی معمولاً بر روی نمونه‌های بافتی تثبیت شده با فرمالین و پارافین استفاده می‌شود.

مزایای استفاده از رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

این تکنیک رنگ آمیزی بسیار اختصاصی، حساس، آسان و مقرون به صرفه است.

محدودیت‌های رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

تکنیک رنگ آمیزی محدود به قارچ‌ها است، ممکن است منفی کاذب یا مثبت کاذب ایجاد کند و معمولاً فقط در نمونه‌های بافتی تثبیت شده با فرمالین و پارافین استفاده می‌شود.

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چگونه کار می‌کند؟

نمونه بافت ابتدا با محلول متنامین نقره تیمار می‌شود که سپس با رنگ آمیزی فوشین رنگ‌آمیزی می‌شود تا کنتراست قارچ افزایش یابد.

روش انجام رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

این روش معمولاً شامل تثبیت نمونه بافت، قرار دادن آن در پارافین و رنگ‌آمیزی آن با متنامین نقره و فوشین است.

آیا رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور مختص قارچ است؟

بله، تکنیک رنگ آمیزی برای قارچ‌ها بسیار اختصاصی است و برای تجسم انواع دیگر میکروارگانیسم‌ها موثر نیست.

آیا رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور می‌تواند نتایج نادرستی ایجاد کند؟

در موارد نادر، تکنیک رنگ آمیزی ممکن است منفی کاذب یا مثبت کاذب ایجاد کند.

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چگونه با سایر تکنیک‌های رنگ آمیزی برای تشخیص قارچ مقایسه می‌شود؟

رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور یک تکنیک بسیار خاص و حساس است که انجام آن آسان و مقرون به صرفه است، اما ممکن است در موارد نادر نتایج نادرستی ایجاد کند.

کاربردهای رنگ آمیزی گوموری متنامین سیلور چیست؟

تکنیک رنگ آمیزی در تشخیص عفونت قارچی، آسیب شناسی، قارچ شناسی پزشکی، تحقیقات میکروبی، نظارت بر محیط زیست، کنترل کیفیت در داروها و ایمنی مواد غذایی استفاده می‌شود.

همچنین بخوانید: