تکنیک ها, کشت سلول, ویدیو های آموزشی
رنگ آمیزی Acridine orange/Propidium iodide
مقدمه‌ای بر رنگ آمیزی Acridine orange/Propidium iodide
برای بررسی میزان زنده مانی در سلول های زنده روش های متفاوت و کارآمدی وجود دارد. یکی از این روش ها بررسی سلول ها تحت تأثیر رنگ های فلورسنت می باشد. رنگ های فلورسنت یا ترکیبات کروموفور خاصیت ویژه‌ای دارند که می توانند در طول موج مشخصی از نور، فوتون های پرانرژی را به خود جذب کرده و الکترون های آن در اثر برانگیختگی به تراز های بالا رفته و سپس بلافاصله انرژی خود را از دست داده و با نشر نور در طول موج هایی بلندتر از نور اولیه، به تراز های پایین باز می گردد.
حال اگر یک ماده فلورسنت توانایی اتصال اختصاصی به ترکیباتی چون نوکلیئک اسید یا پروتئین ها را داشته باشد، می تواند با اتصال اختصاصی خود نتایج ارزشمندی را به ما ارائه کند. ترکیبات Acridine Orange و Propidium Iodide دو رنگ فلورسنت محسوب شده و با اتصال اختصاصی خود می توانند سلول ها را از نظر زنده یا مرده بودن تمییز دهند.
برای رنگ آمیزی فلورسنت و بررسی زنده مانی، دو رنگ مذکور هریک در غلظت های 50 μg/mL باهم ترکیب می شوند. برای رسیدن به این غلظت می توان از هرکدام غلظت 100 μg/mL آماده کرده و با مخلوط کردن حجم یکسان از هزیک به غلظت مورد نظر یعنی 50 μg/mL از هر رنگ در محلول رسید. پس از آماده سازی محلول رنگ، مقدار 10 μL از رنگ با 10 μL از سلول های سوسپانس شده ترکیب و بعد از پیپتاژ کردن، زیر میکروسکوپ فلورسانت مورد ارزیابی قرار می گیرد.
رنگ Acridine Orange یا AO یک ترکیب نارنجی رنگ است که نور با طول موج 500 نانومتر را جذب کرده و بازنشری در طول موج 526 نانومتر ایجاد می کند. طول موج 500 نانومتر در محدوده رنگ آبی روشن قرار گرفته و برای تاباندن نور با این طول موج از فیلتر آبی میکروسکوپ فلورسنت استفاده می شود. پس از دریافت نور در این طول موج، ترکیب کروموفور آکریدین اورنج، نوری با طول موج 526 نانومتر بازنشر می کند که این طول موج در محدوده رنگ سبز قرار گرفته است. لذا رنگی که از تاباندن نور آبی به آکریدین اورنج حاصل می شود، سبز است.
رنگ Propidium Iodide یا PI به دلیل وجود ید، یک ترکیب قرمز رنگ است که نور با طول موج 533 نانومتر را جذب کرده و بازنشری در طول موج 617 نانومتر منتشر می کند. طول موج 533 نانومتر در محدوده رنگ سبز قرار گرفته و برای تاباندن نور با این طول موج از فیلتر سبز میکروسکوپ فلورسنت استفاده می شود. پس از دریافت نور در این طول موج، ترکیب کروموفور پروپیدیوم یدید، نوری با طول موج 617 نانومتر بازنشر می کند که این طول موج نیز در محدوده رنگ نارنجی تیره یا قرمز قرار گرفته است.
رنگ آکریدین اورنج (AO) به راحتی از غشای سلول عبور کرده و به سلول های زنده نفوذ می کند و در نهایت به DNA متصل می شود. اگر رنگ آکریدین اورنج به dsDNA یا همان دئوکسی ریبونوکلیئک اسید دو رشته ای متصل شود در بازنشر نوری رنگ سبز تولید می کند. همچنین اگر به ssDNA یا RNA متصل شود رنگ ضعیفی در محدوده قرمز تولید می کند. پروپیدیوم یدید (PI) نیز توانایی اتصال به نوکلئیک اسید ها را داشته ولی توانایی نفوذ به سلول های زنده را ندارد. این رنگ توسط سلول های غیر زنده و سلول هایی با غشای در حال تکه تکه شدن جذب می شود.
زمانی که رنگ پروپیدیوم یدید (PI) به DNA متصل شود، خاصیت فلورسانتی آن 20 تا 30 برابر افزایش یافته و سلول را با رنگ فرمز نشان می دهد. از طرفی رنگ پروپیدیوم یدید نور ساطع شده از آکریدین اورنج را به خود جذب کرده و اجازه نمی دهد سلول های غیر زنده بازنشری از جانب رنگ آکریدین اورنج داشته باشند و این مسئله موجب می گردد آزمایش با خطای کمتری مواجه شود.
می توان گفت در نهایت پس از رنگ آمیزی سلول ها با مخلوط رنگ های PI/AO می توان از هر سلولی دو عکس در فیلتر های آبی و سبز گرفته و این دو عکس را باهم ترکیب کرد. اگر در عکس ترکیب شده، سلولی فقط به رنگ سبز دیده شود نشان دهنده‌ی زنده بودن سلول (Viabile Cell) می باشد. همچنین اگر به رنگ قرمز دیده شود نشان دهنده‌ی نکروز شدن سلول (Necrotoc Cell) می باشد.
اگر سلولی در فیلتر سبز رنگ قرمز را نشان دهد و همچنین در فیلتر قرمز رنگ سبز را از خود نشان دهد در ترکیب دو عکس به رنگ نارنجی در می آید که این مسئله نشان دهنده سلول های آپوپتوز شده (Apoptotic Cell) می باشد. در کارآموزی کشت سلول های جانوری ژنیران، دانشجویان پس از استخراج سلول های PBMC از خون، هریک به بررسی زنده مانی سلول های خود با استفاده از رنگ آمیزی AO/PI می پردازند. همچنین یکی از دلایلی که این رنگ آمیزی برای این نوع سلول ها در نظر گرفته شده است، بررسی ناخالصی سلول ها با گلبول های قرمز نیز می باشد.
زمانی که دانشجویان سلول های تک هسته‌ای خون را جدا می کنند، طبیعتاً مقدار زیادی گلبول قرمز نیز با سلول ها استخراج می کنند. برای نشان دادن کیفیت کار دانشجویان، پس از اتمام استخراج نمونه یکبار زیر میکروسکوپ نوری بررسی شده و سپس رنگ آمیزی AO/PI روی آن صورت پذیرفته و در فیلتر های فلورسانت بررسی می شود. قابل توجه است گلبول های قرمز خون فاقد هسته بوده و توسط رنگ های فلورسانتی که خاصیت اتصال به نوکلئیک اسید ها دارند، رنگ نمی شوند.
همچنین بخوانید:
رنگ های رومانوفسکی: اصول، انواع، کاربردها
برای رنگ آمیزیاکریدین اورنج بعد از کاشتن سلول ها در چاهک و گذشت ۲۴ساعت ،قبل از زدن دارو به سلول ها آیا باید محیط کشت سلول ها با محیط تازه عوض شود؟
و حتما باید سلول ها قبل از زدن رنگ با pbs شستشو داده وسلول ها را با پلیت زیر میکروسکوپ دید؟
برای رنگ‌آمیزی و آزمایش دارویی روی سلول‌ها، اطمینان حاصل کنید که:
محیط کشت را قبل از افزودن دارو تعویض کنید.
سلول‌ها را با PBS شستشو دهید تا پاکیزگی نمونه حفظ شود.
برای مشاهده فلورسنس، از پلیت مناسب میکروسکوپ استفاده کنید.
با سلام و تشکر از مطالب مفید شما
برای سلول های چسبان محلول رنگ آمیزی مستقیما روی سلول ریخته میشود و پیپتاژ انجام نمیگردد اما متاسفانه سلول ها روی هم می افتند و تشخیص سخت میشود لطف میکنید راهکاری برای رفع مشکل بفرمایید.ممنونم
مشکل تجمع سلول‌ها و افتادن آنها روی هم هنگام رنگ‌آمیزی با آکریدین اورنج یک چالش رایج است که می‌تواند بر دقت و کیفیت تجزیه و تحلیل نمونه‌ها تأثیر بگذارد. برای رفع این مشکل، چند راهکار مؤثر وجود دارد که می‌توانید آنها را امتحان کنید:
۱. بهبود روش افزودن رنگ
افزودن آرام رنگ: به جای ریختن مستقیم رنگ روی سلول‌ها، می‌توانید رنگ را به آرامی و به صورت قطره‌قطره اضافه کنید تا فشار کمتری به سلول‌ها وارد آید. این کار می‌تواند از تجمع و تخریب ساختار سلولی جلوگیری کند.
۲. استفاده از ماتریس پلیمری
پوشش دهی با ماتریس: برخی از آزمایشگاه‌ها از یک لایه نازک ماتریس پلیمری برای پوشش دادن سطح قبل از رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنند. این ماتریس می‌تواند به سلول‌ها کمک کند تا در جای خود باقی بمانند و کمتر تحت تأثیر افزودن مواد شیمیایی قرار گیرند.
۳. تغییر در غلظت رنگ
کاهش غلظت رنگ: بررسی کنید که آیا می‌توانید غلظت رنگ آکریدین اورنج را کاهش دهید. گاهی اوقات استفاده از غلظت بالای رنگ می‌تواند به سلول‌ها فشار وارد کند و باعث تجمع آنها شود.
۴. استفاده از فیکساتیو
فیکس کردن نمونه: قبل از افزودن رنگ، ممکن است لازم باشد که سلول‌ها را با استفاده از ماده فیکس‌کننده مانند پارافرمالدئید فیکس کنید. فیکس کردن سلول‌ها می‌تواند به حفظ ساختار و جلوگیری از تخریب آنها کمک کند.
عالی بود ممنونم
خوشحالیم که مفید بوده
سلام، ممنون از توضیحات خوبتون
برای این که بک گراند کاملا تیره باشد و هاله قرمز و سبز نداشته باشد باید چه کاری انجام داد؟ فقط رنگ در سلول ها مشخص باشد.
آیا حتما نیاز هست که سلول ها تریپسینه شوند؟ نمیشود وقتی کف پلیت هستند رنگ روی آنها ریخت و بعد عکس گرفت؟
سلام
وقت بخیر
شدت نور دوربین را می توانید پایین بیاورید تا نور های اضافی حذف شود.
سلام
ادغام تصاویر با IMAGJ هست یا انداختن دو فیلتر روی هم؟ و واسه سلول روی داربست سه بعدی هم همینطوره؟ سپاس از شما
برای ادغام تصاویر، ابتدا عکس در دو فیلتر به شکل مجزا گرفته شده و سپس در نرم افزار ImageJ ادغام انجام می شود. برای داربست هم به همین شکل است اما باید توجه داشت از داربست هایی در این تکنیک می توان استفاده نمود که ضخامت کمی داشته باشند تا در عکس برداری سلول ها رو هم نیفتند.
درود برشما☀️☀️
عالی هستید، عالی بمانید🌸🌸🌸
سلام، ممنون دوست عزیز.