روش‌های نگهداری باکتری و قارچ

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر روش‌های نگهداری باکتری و قارچ

حفظ زیستی (Biopreservation) فرآیند حفظ سلامت و کارایی سلول‌ها است.
اکثر آزمایشگاه‌های باکتری‌شناسی، کشت‌های ذخیره میکروارگانیسم‌ها را برای اهداف آموزشی، تحقیقاتی، زیست‌سنجی، صنعتی یا سایر اهداف نگهداری می‌کنند.
طیف گسترده‌ای از تکنیک‌ها برای حفظ باکتری‌ها در دسترس هستند و ممکن است انتخاب روشی برای یک سویه خاص که نه تنها بقای آن را تضمین کند، بلکه باعث شود ژنوتیپ (Genotype) و در نتیجه ویژگی‌های منحصر به فرد آن سویه تغییر نکند، دشوار باشد.
هدف اولیه حفظ کشت، زنده نگه داشتن ارگانیسم، بدون آلوده شدن و بدون تغییر یا جهش است، یعنی حفظ کشت در شرایطی که تا حد امکان نزدیک به ایزوله اصلی باشد.

آگار کشت‌های شیب‌دار (Agar Slant Culture)

همه آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، میکروارگانیسم‌ها را در آگار شیب‌دار نگهداری می‌کنند.
آگارهای شیب‌دار تلقیح شده و تا زمانی که رشد خوب ظاهر شود، انکوبه می‌شوند.
سپس آن‌ها را با روغن معدنی استریل تا عمق 1 سانتی متر بالاتر از نوک سطح شیب‌دار می‌پوشانند.
کشت‌های شیب‌دار به مدت 24 ساعت یا بیشتر انکوبه و سپس در یخچال نگهداری می‌شوند.
این کشت‌ها به صورت دوره‌ای به محیط‌های تازه منتقل می‌شوند.
انتقال با برداشتن یک لوپ (Loop) پر از کشت رشد کرده، زدن لوپ به سطح شیشه برای تخلیه روغن اضافی، تلقیح یک محیط تازه و سپس نگهداری کشت ذخیره اولیه، انجام می‌شود.
فواصل زمانی که در آن انتقال انجام می‌شود، با منشاء و شرایط رشد متفاوت است.
این یک روش ساده و مقرون ‌به صرفه برای نگهداری باکتری‌ها و قارچ‌ها است که در آن برای چندین سال در دمای اتاق زنده می‌مانند.

نگهداری در یخچال

کشت‌های خالص را می‌توان با موفقیت در دمای 0 تا 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال و یا در اتاق‌های سرد نگهداری کرد.
این روش برای مدت کوتاهی (2 تا 3 هفته برای باکتری‌ها و 3 تا 4 ماه برای قارچ‌ها) استفاده می‌شود، زیرا فعالیت‌های متابولیکی میکروارگانیسم‌ها بسیار کند می‌شود اما متوقف نمی‌شود.
بنابراین رشد آن‌ها به کندی ادامه می‌یابد، مواد مغذی مورد استفاده قرار می‌گیرند و مواد زائد در محیط آزاد می‌شوند. این امر پس از مدتی در نهایت منجر به مرگ میکروب‌ها می‌شود.

روش پارافین (Paraffin)

این روش یک روش ساده بوده و مقرون به صرفه‌ترین روش برای نگهداری کشت خالص باکتری‌ها و قارچ‌ها است.
در این روش پارافین مایع استریل روی سطح شیب‌دار کشت ریخته و در دمای اتاق به صورت عمودی نگهداری می‌شود.
لایه پارافین شرایط بی‌هوازی را تضمین و از کم آب شدن محیط جلوگیری می‌کند.
این شرایط به میکروارگانیسم‌ها یا کشت خالص کمک می‌کند تا در حالت خفته باقی بمانند و بنابراین کشت برای چندین سال حفظ می‌شود.

سوسپانسیون نمکی

کلرید سدیم در غلظت بالا اغلب یک مهارکننده رشد باکتری است.
باکتری‌ها در محلول نمک 1% (غلظت غیرکشنده در لوله‌های درپوش پیچی برای جلوگیری از تبخیر) معلق می‌شوند.
لوله‌ها در دمای اتاق نگهداری می‌شوند. هر زمان که نیاز باشد، انتقال از روی سطح شیب‌دار آگار انجام می‌شود.

سرماداری (Cryopreservation)

سرماداری (به عنوان مثال، انجماد در نیتروژن مایع در دمای 196- درجه سانتی‌گراد) به بقای کشت‌های خالص برای مدت زمان ذخیره‌سازی طولانی کمک می‌کند.
در این روش، میکروارگانیسم‌های کشت به سرعت در نیتروژن مایع در دمای 196- درجه سانتی‌گراد در حضور عوامل تثبیت کننده مانند گلیسرول (Glycerol) که از تشکیل کریستال‌های یخ جلوگیری و بقای سلول را تقویت می‌کند، منجمد می‌شوند.

لیوفیلیزاسیون (Lyophilisation) (انجماد- خشک شدن)

در این روش، کشت به سرعت در دمای بسیار پایین (حدود 70- درجه سانتی‌گراد) منجمد و سپس با قرار دادن در محیط خلاء، بی‌آب می‌شود.
تحت این شرایط، سلول‌های میکروبی بی‌آب شده و فعالیت‌های متابولیکی آن‌ها متوقف می‌شود. در نتیجه میکروب‌ها به حالت خفته رفته و سال‌ها زنده می‌مانند.
کشت‌های خالص لیوفیلیزه یا منجمد- خشک شده و سپس پوشانده شده و در تاریکی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال نگهداری می‌شود.
روش انجماد- خشک کردن رایج‌ترین روش مورد استفاده مراکز جمع آوری کشت است.

فرآیند لیوفیلیزاسیون

در این فرآیند سوسپانسیون میکروبی در ویال‌های کوچک قرار می‌گیرد.
یک لایه نازک روی سطح داخلی ویال با چرخاندن آن در مخلوطی از یخ خشک (دی اکسید کربن جامد) و الکل یا استون (Acetone) در دمای 78- درجه سانتی‌گراد منجمد می‌شود.
ویال‌ها بلافاصله به یک خط خلاء بالا انتقال می‌یابند. این امر ارگانیسم را در حالی که هنوز یخ زده است، خشک می‌کند.
در نهایت آمپول‌ها در خلاء با شعله کوچک مهر و موم می‌شوند.
این کشت‌ها را می‌توان برای چندین سال در دمای 40 درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد.
این روش همچنین برای نگهداری سموم، سرم‌ها، آنزیم‌ها و سایر مواد بیولوژیکی استفاده می‌شود.
برای احیای کشت‌های میکروبی، تنها لازم است که ویال را به صورت آسپتیک (Aseptic) باز کنید، یک محیط غیر تازه مناسب اضافه کرده و پس از انکوباسیون، انتقال‌های بیشتری انجام دهید.
این فرآیند امکان نگهداری تعداد بیشتری از کشت‌ها بدون تغییر در ویژگی‌های آن‌ها را فراهم کرده و خطر آلودگی را تا حد زیادی کاهش می‌دهد.

نگهداری در دمای بسیار پایین

ارگانیسم‌ها در نوترینت براث (Nutrient broth) حاوی 15 درصد گلیسرول قرار داده می‌شوند.
سوسپانسیون منجمد شده و در دمای 15- تا 30- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شود.