تکنیک ها
روش های الکتروفورز محصول PCR (آگارز و آکریل آمید)
زمانی که پروسه PCR به اتمام رسید، محصولات درون ویال های مختلف حاوی اسیدهای نوکلئیک تکثیر شده می باشند. مهم ترین مرحله هر PCR بخش Post PCR یا همان الکتروفورز با ژل می باشد؛ چرا که نشان دهنده نتایج حاصل از PCR خواهد بود. الکتروفورز در نهایت نشان خواهد داد که کیفیت PCR انجام شده به چه شکل است. عموماً هدف از الکتروفورز بیومولکول ها جدا سازی آن ها بر اساس وزن مولکولی و برخی اوقات بر اساس بار می باشد که در اثر این جداسازی هریک از بیومولکول های با وزن یکسان به شکل باند در ژل الکتروفورز نمایان می شوند.
اساس الکتروفورز حرکت بیومولکول ها بر اساس بارشان درون خلل و فرج ژل می باشد. ژل یک بستر منفذ دار را تشکیل می دهد که اسید های نوکلئیک و پروتئین ها می توانند درون آن منافذ حرکت کنند. درصد ژل رابطه عکس با منافذ خود دارد، لذا هرچقدر ژل غلیظ تر و درصد بالاتری داشته باشد منافذ کوچک تری خواهد داشت. در سیستم الکتروفورز بر اساس بار مولکولی یک بیومولکول، چاهک هایی در یک سمت ژل ایجاد می شود و نمونه های مورد الکتروفورز درون آن وارد می شود. ژل الکتروفورز درون تانک الکتروفورز که از بافر مخصوص پر شده، قرار گرفته و تحت تأثیر جریان الکتریکی قرار می گیرد. تانک الکتروفورز در یک سمت قطب مثبت (آند) و در سمت دیگر قطب منفی (کاتد) دارد، که هر کدام از آن ها با توجه به مثبت و منفی بودن به منبع تغذیه متصل می شود. اگر که نمونه ما بار منفی داشته باشد چاهک ها در سمت قطب منفی و اگر نمونه بار مثبت داشته باشد چاهک ها در سمت قطب مثبت قرار می گیرند.
اسید های نوکلئیک به دلیل وجود گروه های فسفات در Back Bone خود، بار منفی داشته و به عنوان آنیون همیشه می توانند از سمت قطب کاتد به سمت آند حرکت کنند. لذا چاهک های ژل در الکتروفورز اسید های نوکلئیک همیشه در سمت قطب کاتد قرار می گیرد. اسید های نوکلئیک کوچکتر با سرعت بالاتر و آن هایی که بزرگ تر هستند با سرعت کمتر حرکت می کنند. لذا پس از الکتروفورز چند نمونه DNA در زمان مشخص، براساس حرکت و قرارگیری آن ها می توان به اندازه اشان پی برد. همچنین هرچقدر غلظت نمونه بیشتر باشد باند تشکیل شده پهنای بیشتری خواهد داشت. عموماً در الکتروفورز یکی از چاهک ها اختصاص با نمونه Ladder می باشد. نمونه Ladder حاوی ترکیباتی از جنس نمونه ای که قرار است الکتروفورز شود، می باشد که در وزن های مختلف تهیه شده است. با لود کردن نمونه Ladder در یکی از چاهک ها، ما تعدادی باند در راستای چاهک Ladder خواهی داشت که مانند یک خط کش عمل کرده و هر کدام وزن مولکولی مشخصی دارد. لذا با تطبیق نمونه های مجهول با باند های Ladder، می توان وزن تقریبی نمونه مجهول را حدس زد.
اسید های نوکلئیک به دو روش افقی و عمودی الکتروفورز می شوند. عموما از ژل آگارز برای الکتروفورز افقی و ژل پلی آکریل آمید برای الکتروفورز عمودی استفاده می شود. در دوره‌ی کارآموزی ژنتیک مولکولی آزمایشگاه ژنیران الکتروفورز افقی با ژل آگارز و الکتروفورز عمودی با ژل پلی آکریل آمید به دفعات تکرار شده و دانشجویان با این دو تکنیک به خوبی آشنا می شوند
سلام وقتتون بخیر
من برای ستاپ پرایمرم pcr گرادیانت گذاشتم اما اصلا در هیچ دمایی باند شارپ نداد cdna رو عوض کردم و با پرایمر های قبلیم چک کردم اون ها اوکی بودن اما این جدید مشکل داره پیشنهاپتون چیه برای تقویت باند؟
وقتی با مشکل در دریافت باندهای شارپ در PCR گرادیانت مواجه می‌شوید و مشکل از cDNA نیست (چون با پرایمرهای دیگر نتایج خوبی داشته‌اید)، موارد زیر را برای بهبود وضعیت باندهای PCR بررسی و امتحان کنید:
بررسی طراحی پرایمر: اطمینان حاصل کنید که پرایمرها به درستی طراحی شده‌اند. پرایمرها باید دارای Tm (دمای ذوب) مناسب و همچنین طول و ترکیب GC مناسب باشند. از وجود هرگونه ساختارهای ثانویه یا دیمرهای پرایمر که می‌تواند باعث اختلال شود، جلوگیری کنید.
اصلاح غلظت مگنزیم: MgCl2 در فعال‌سازی آنزیم Taq پلیمراز نقش دارد و غلظت آن می‌تواند بر کیفیت PCR تأثیر بگذارد. امتحان کردن غلظت‌های مختلف مگنزیم ممکن است به شما کمک کند تا به باند شارپ‌تری دست یابید.
تنظیم غلظت پرایمر: گاهی اوقات غلظت پرایمر بیش از حد بالا یا پایین می‌تواند بر کیفیت PCR تأثیر بگذارد. تنظیم غلظت پرایمر ممکن است نیاز به آزمون و خطا داشته باشد.
بهینه‌سازی دوره‌های ترموسایکلینگ: تنظیم دقیق دما و زمان‌های دوره‌های ترموسایکلینگ می‌تواند به بهبود نتایج کمک کند. ممکن است نیاز باشد زمان تمدید یا تعداد چرخه‌ها را تغییر دهید.
استفاده از افزودنی‌ها: گاهی اوقات افزودن موادی مانند DMSO یا بتائین به مخلوط واکنش می‌تواند به کاهش ساختارهای ثانویه در تمپلیت و بهبود باند کمک کند.
کنترل کیفیت cDNA و تمپلیت: حتی اگر با cDNA دیگری موفقیت داشته‌اید، همچنان کیفیت و غلظت cDNA مورد استفاده برای پرایمرهای جدید را بررسی کنید. اطمینان حاصل کنید که cDNA به اندازه کافی غنی و بدون آسیب است.
تجدید نظر در طراحی پرایمر: اگر هیچ یک از تغییرات بالا کمک نکرد، ممکن است لازم باشد طراحی پرایمرها را مجدداً بررسی کنید یا حتی پرایمرهای جدیدی طراحی کنید.
انجام این بهینه‌سازی‌ها می‌تواند به شما کمک کند تا به نتایج بهتری در PCR خود دست یابید. همچنین، مشورت با همکاران یا مراجعه به منابع تخصصی می‌تواند ایده‌های ارزشمندی برای حل مشکل فراهم آورد.
سلام وقت بخیر..ببخشید پرایمر من هنگام تست روی ژل افقی باند تشکیل داده ولی وقتی روی ژل عمودی گذاشتم باندهای کلفتی پایین تر از خط لدر تشکیل شد علتش چی میتونه باشه؟
سلام،
طبیعی است که پرایمر با سایز حدود 20 تا 25 نوکلئوتید پایین تر از آخرین خط لدر (در صورتی که از لدر 50 bp استفاده می‌کنید) قرار گیرد.
سلام علت گیر کردن محصول پی سی ار در چاهک ژل چیه؟
حتی محصول رو رقیق کردیم و درصد ژل رو پایین اوردیم باز جواب نگرفتیم
با سلام، موارد زیر را میتوانید امتحان کنید:
1. محصول را تا 25 نانوگرم در ماکرولیتر رقیق کنید.
2. آگارز را به یک درصد برسانید.
3. از درست کار کردن پاورسوپلای و اتصالات برقی آن اطمینان حاصل کنید.
باسلام
بنده می‌خوام در کارگاه آموزشی استخراج DNA و PCR و الکتروفورز باطل آگارز شرکت کنم لطفاً تاریخ و زمان برگزاری کارگاه و همچنین هزینه شرکت در کارگاه را اعلام فرمایید.باسپاس
سلام دوست عزیز
شما میتوانید در دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی شرکت کنید برای اطلاعات بیشتر و مشاوره رایگان با آزمایشگاه تماس بگیرید. همچنین میتوانید صفحه زیر را مطالعه کنید.(کلیک کنید)
کارآموزی ژنتیک مولکولی