روش های ایمونولوژی و سرولوژی در آزمایشگاه تشخیص طبی

واکنش های آنتی ژن و آنتی بادی

پیوند یا واکنش آنتی ژن و آنتی بادی دارای سه مشخصه اصلی اختصاصی بودن، برگشت پذیری و گرمازایی می باشد. منظور از اختصاصی بودن واکنش یا پیوند آنتی ژن و آنتی بادی این است که یک آنتی بادی از بین هزاران مولکول فقط توانایی اتصال به اپی توپ یک آنتی ژن خاص را دارد که این اپی توپ خاص را اپی توپ اختصاصی آن آنتی بادی می نامند. آختصاصی بودن پیوند آنتی ژن و آنتی بادی باعث تحول عظیمی در روش های تشخیص طبی شده است.

زیرا این ویژگی پیوند آنتی ژن و آنتی بادی منشا پایه ریزی روش های متعددی بریا شناسایی، ردیابی و اندازه گیری مولکول های متنوعی در علوم پزشکی بوده است. روشهایی که با این اصل پایه ریزی شده اند روشهای ایمنولوژیک نامیده می شوند. منشاء این ویژگی یا اختصاصی بودن، مکمل بودن شکل فضایی اپی توپ و پاراتوپ است.

پس ازینکه پیوند بین یک آنتی بادی و یک آنتی ژن به خاطر مکمل بودن شکل فضایی برقرار شد، این اتصال برای پایداری نیاز به نیروی جاذبه دارد. این اتصال توسط نیروهای جاذبه با قدرت کم ( کمتر از 10 کیلوکالری بر مول) برقرار می گردد. این نیروها عبارتند از:

• نیروهای الکترواستاتیک بین گروههای Coo^– و NH3⁺
• پیوند هیدروژن بین اتم های H⁺ و N^– یا O^–
• پیوند هیدروفوب بین اسید های آمینه حلقوی
• نیروی واندروالسی حاصل حرکت الکترونها بین دو مولکول

پیوند بین آنتی ژن و آنتی بادی یک واکنش گرمازا بوده که حدود 2 تا 40کیلوکالری بر مول انرژی آزادی می نماید.

عوامل متعددی مانند حرارت، اسیدی شدن محیط و مولاریته های خیلی بالا می توانند باعث جدا شدن آنتی ژن از آنتی بادی گردند. بنابراین پیوند بین آنتی ژن و آنتی بادی یک پیوند برگشن پذیر می باشد. تفاوت این پیوند برگشت پذیر در مقایسه با پیوند اختصاصی برگشت پذیر آنزیم و سوبسترا، عدم تغییر هر یک از عوامل درگیر در واکنش پس از اتصال و جدا شدن می باشد. بنابراین در شرایط آزمایشگاهی در صورت نیاز می توان پیوند جفت آنتی ژن و آنتی بادی را شکست  و آنها را از یکدیگر جدا نمود.

نیروهای درگیر در پیوند آنتی زن و آنتی بادی نیروهای بسیار ضعیفی هستند. این نیروها فقط در فاصله های بسیار نزدیک کمتر ازیک آنگستروم عمل می کنند.

بنابراین مکمل بودن شکل فضایی اپی توپ و پاراتوپ نقش بسیار مهمی را در قدرت پیوند ایجاد شده ایفا می کند. هر چه اپی توپ و پاراتوپ به لحاظ شکل فضایی بیشتر مکمل یکدیگر باشند، دو مولکول با فاصله نزدیکتری نسبت به یکدیگر قرار می گیرند. بنابراین نیروهای اعمال شده در اتصال دارای قدرت بیشتری خواهند بود و پیوند برقرار شده دارای ثبات بیشتری می باشد. قدرت پیوند ایجاد شده بین یک اپی توپ و یا پاراتوپ را افینیتی (Affinity) می نامند. هر چه افینیتی یک پاراتوپ برای یک اپی توپ بیشتر باشد قدرت اتصال برقرار شده بیشتر است.

طبقه بندی واکنش های آنتی ژن و آنتی بادی

واکنش های ایمونولوژیک را می توان بر اساس نحوه مشاهده واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی طبقه بندی نمود. بر این اساس، واکنش های ایمونولوژیک به سه گروه عمده تقسیم بندی می شوند که در هریک از گروه ها، روش های مختلفی قرار می گیرند.

مشاهده مستقیم واکنش آنتی ژن و آنتی بادی
ایمونوپرسیپیتاسیون					آگلوتیناسیون
در محیط مایع		در محیط ژل			مستقیم			غیر مستقیم
توربیدومتری نفلومتری		SRID, DID ایمونوالکتروفورز			ذرات غیر محلول			مولکول های محلول
					هماگلوتیناسیون			لاتکس آگلوتیناسیون
مشاهده واکنش آنتی و آنتی بادی با استفاده از یک نشانگر
RIA		EIA			IFA			CLIA
رقابتی	IRMA	هوموژن		هتروژن	مستقیم	غیر مستقیم		هوموژن	هتروژن
مشاهده اثرات بیولوژیک حاصل از پیوند آنتی ژن و آنتی بادی
لیز سلولی			خنثی سازی				بی حرکت سازی
روش ثبوت و مکمل ( CFT)			Toxin Neutralization				Anti-sperm antibody

 

حساسیت روش های ایمونولوژیک

کمترین مقداری از یک مولکول که توسط یک روش میتوان اندازه گیری نمود حساسیت (Sensitivity) آن روش می نامند. یکی از مشخصه های مهم روش های ایمونولوژیک، حساسیت آنها می باشد. یک عامل مهم در انتخاب روش برای اندازه گیری یک مولکول، با توجه به میزان آن مولکول در محیطی که قصد اندازه گیری آن را داریم حساسیت روش می باشد.

مقایسه (تقریبی) حساسیت روش های مختلف ایمونولوژیک
روش	حساسیت( µg/ml)
ایمونوالکتروفورز	50-200
روش های رسوب گذاری در مایع	1-10
روش های رسوب گذاری در محیط ژل (DID, SRID)	3-20
هماگلوتیناسیون مستقیم	0.01-0.001
روش ثبوت مکمل (CFT)	0.01-0.05
ایمونوفلورسانت	1
آگلوتیناسیون مستقیم (باکتریایی)	0.01
وسترن بلات	0.01
آگلوتیناسیون غیر مستقیم (لاتکس)	0.001
رادیو ایمونواسی (RIA)	0.001-0.00001
آنزیم آیمونواسی (EIA)	0.001-0.00001
کمی لومینسانت ایمنواسی (CLIA)	0.001-0.00001

 

روش های آگلوتیناسیون

مقدمه

واکنش آگلوتیناسیون برای اولین بار توسط میکروب‌شناس‌ها مشاهده شد. سپس تشخیص آنتی بادیها بر علیه میکروارگانیسم ها در سرم انسان توسط این روش ساده باعث ایجاد رشته ای به نام سرولوژی گردید. استفاده از این روش ساده علاوه بر کمک به درک مکانیسم بیماریهای عفونی باعث کشف گروههای خونی ABO گردید. در نهایت پیشرفت تکنولوزی و استفاده از ذرات خنثی ( مانند لاتکس) باعث استفاده وسیع این روش گردید.

آگلوتیناسیون یکی از روش های ایمنولوژی است که کاربرد آن به این رشته محدود نمی شود. از این روش در شاخه های متعدد علوم پزشکی ( مانند ایمنولوژی، سرولوژی، میکروب شناسی، ویروس شناسی، هماتولوژی و …) استفاده های وسیعی جهت ارزیابی آنتی ژن و آنتی بادی ها می شود.

آگلوتیناسیون در طیقه بندی واکنش های آنتی ژن- آنتی بادی، در گروه اول (آگلوتیناسیون و پرسیپیتاسیون) قرار دارد، زیرا از روش های آگلوتیناسیون می توان برای شناسایی آنتی ژنهای غیر محلول در یک نمونه یا وجود آمنتی بادی در نمونه بر علیه آنتی ژنهای غیر محلول استفاده نمود و مشاهده آن بطور مستقیم و بدون استفاده از نشانگر امکان پذیر می باشد.

در تعریف، آگلوتیناسیون عبارت است از تشکیل توده های قابل رویت از ذرات، که ناشی از واکنش اختصاصی میان تعدادی اگلوتینین( معمولا آنتی بادی) و تعدادی آکلوتینوژن ( معمولا آنتی ژن) می باشد.

بطور کلی واکنش آگلوتیناسیون در دو مرحله شکل می گیرد. در مرحله اول آنتی بادی های موجود در محیط با شاخص های آنتی ژنیک آنتی ژن ذره ای (مانند RBC و با لاتکس) متصل می گردند. در مرحله بعد، در صورت فراهم بودن شرایط، شبکه ای از ذرات موجود تشکیل خواهد شد که با چشم غیر مسلح قابل رویت خواهد بود.

اساس واکنش های آگلوتیناسیون

هر گاه واکنشی بین یک انتی بادی و آنتی ژن غیر محلول (Insoluble  or Particulate) انجام پذیرد، نتیجه آن ظهور واکنش آگلوتیناسیون می باشد. منظور زا آنتی ژنهای غیر محلول ( یا شاخص های آنتی ژنیک غیر محلول) ان هایی هستند که بر روی سطح سلول ها ( گلبول قرمز، باکتری ها) موجود می باشند.

وجود سلول ها باعث غیر محلول شدن این شاخص های آنتی ژنیک یک سلول و از طرف دیگر به شاخص آنتی ژنیک موجود بر رئی سلول دیگر متصل گردد و به این صورت باعث اتصال دو سلول به یکدیگر شود. اگر این واکنش به همین ترتیب ادامه یابد، شبکه ای از تعداد زیادی سلول مرتبط توسط آنتی بادی ها بوجود خواهد آمد که این شبکه به صورت سلول های تجمع یافته، غیر محلول، با چشم غیر مسلح قابل رویت می باشند.

بنابراین واکنش آگلوتیناسیون مانند سایر واکنش های رسوبی متشکل از شبکه ای از آنتی ژنها و آنتی بادی ها می باشد. عواملی که واکنش های رسوبی را تحت الثیر خود قرار می دهد تا حدود زیادی بر واکنش های آگلوتیناسیون نیز موثرند.

انواع واکنش های آگلوتیناسیون

انواع متفاوتی از روش های آگلوتیناسیون وجود دارند که اساس این طبقه بندی نوع ارتباط بین آنتی ژن و حامل می باشد. بر اساس این ارتباط، دو گروه اصلی آگلوتیناسیون را می توان تفکیک نمود که عبارتند از روش های مستقیم Direct)  یا Active ) و روش های غیر مستقیم Indirect)  یا  Passive).

اما در هر یک از این گروه های اصلی عواملی چون نوع حامل، عامل متصل بر رروی حامل ( آنتی ژن و یا آنتی بادی) و مهار و یا عدم مهار آگلوتیناسیون بوسیله آنتی ژن و یا آنتی بادی، باعث ایجاد روش های متعدد می گردد.

طبقه بندی انواع روش های آگلوتیناسیون بر اساس نوع حامل و ارتباط آن با آنتی ژن یا آنتی بادی با ذکر مثال

واکنش های آگلوتیناسیون	آگلوتیناسیون مستقیم	هماگلوتیناسیون	حامل، گلبول قرمز	گروه خونی
		آگلوتیناسیون	حامل، ذرات میکروب	ویدال
	آگلوتیناسیون غیر مستقیم	هماگلوتیناسیون	مهار هم آگلوتیناسیون	سرخجه
			هم آگلوتیناسیون	سیفلیس
		آگلوتیناسیون	آگلوتیناسیون	RF, CRP
			مهار آگلوتیناسیون	HCG

 

آگلوتیناسیون مستقیم

هرگاه مولکول آنتی ژن، جزئی از حامل باشد و بطور طبیعی غیر محلول باشد، روش را آگلوتیناسیون مستقیم می نامیم. برای مثال گلبولهای سفید، پلاکت ها، اسپرماتوزوئیدها، باکتری ها، انگل ها و …

هماگلوتیناسیون مستقیم

هر گاه عاملی که باعث غیر محلول شدن آنتی ژن می گردد، گلبول قرمز باشد روش را هماگلوتیناسیون می نامند. مثال این دسته از واکنش ها تعیین گروه خونی می باشد. اساس یکی از آزمایش های تعیین گروه خونی، مشخص نمودن نوع آنتی ژنهای موجود بر سطح گلبول های قرمز می باشد که این کار با استفاده از روش آگلوتیناسیون به سهولت انجام پذیر است.

روش های آگلوتیناسیون غیر مستقیم

وقتی که آنتی ژن را با هدف غیر محلول ساختن، بطور مصنوعی بر روی حامل متصل کنیم، روش را آگلوتیناسیون غیر مستقیم می نامند. در این نوع آگلوتیناسیون، اغلب از گلبول های قرمز، گویچه های لاتکس و پلی استیرن یا ذرات کریستال و زغال به عنوان حامل بریا غیر محلول ساختن آنتی ژن ها استفاده می شود.

روش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم

هر گاه حامل مورد استفاده برای غیر محلول ساختن آنتی ژن، گلبول قرمز باشد، روش را هماگلوتیناسیون غیر مستقیم می نامند. برای مثال یکی از روش های تشخیص سیفلیس، هماگلوتیناسیون تروپونما پالیدوم می باشد. در این روش آنتی ژن ترپونما تحت فورمل  و با استفاده از اسید تانیک بر روی سطح گلبولهای قرمز متصل می گردد.

مهار اگلوتیناسیون

هر گاه واکنش بین آنتی بادی و آنتی ژن نامحلول باعث جلوگیری از آگلوتیناسیون شود، روش را مهار آگلوتیناسیون می نامند.

از این روش برای اشکارسازی یک آنتی ژن در مایعات بیولوژیک استفاده می شود. اساس این آزمایش بر رقابت بین آنتی ژن موجود در نمونه ( بصورت ازاد در محیط) و همان آنتی ژن متصل بر روی ذرات، استوار می باشد.

رقابت بین آنتی ژن متصل شده و آنتی ژن آزاد برای اتصال با آنتی بادی اختضصاصی ( اضافه شده به محیط) انجام می گیرد. غلظت آنتی بادی اضافی شده بصورتی انتخاب می شود تا وجود آنتی ژن آزاد محیط باعث ممانعت از اتصال آنتی ژن های ثابت شده می گردد. از این روش برای بررسی وجود HCG در ادرار خانم های باردار بعنوان تست حاملگی استفاده می شود.