مقدمه‌ای بر شمارش میکروسکوپی مستقیم
مطالعاتی که شامل آنالیز مواد از جمله غذا، آب، شیر و در برخی موارد هوا می‌شود، نیازمند شمارش کمی میکروارگانیسم‌های موجود در این مواد هستند.
روش‌های زیادی برای انجام این کار ابداع شده‌اند، از جمله: شمارش میکروسکوپی مستقیم، استفاده از یک شمارنده سلول‌های الکترونیکی مانند Coulter Counter، روش‌های شیمیایی برای تخمین جرم سلولی یا اجزای سلولی، و اندازه‌گیری‌های کدورت‌سنجی برای افزایش جرم سلولی و رقت‌سازی سریالی (Serial dilution) (روش پلیت آگار (agar plate method))
شمارش میکروسکوپی مستقیم چیست؟
شمارش میکروسکوپی مستقیم نیاز به استفاده از یک لام اختصاصی به نام محفظه شمارش Petroff-Hausser دارد که در آن مقدار کمی از سوسپانسیون سلول یوکاریوتی (eukaryotic) شمارش و تعداد کل سلول‌ها با استفاده از قوانین ریاضیات تعیین می‌شود.
محفظه شمارش Petroff-Hausser یک لام میکروسکوپی شیشه‌ای ضخیم با محفظه‌ای به عمق 0.02 میلی‌متر ( میلی‌متر) در مرکز است.
محفظه شامل یک شبکه اچ شده (Etch) و خط‌کشی‌های Neubauer (نئوبار) بهبود یافته ( میلی‌متر مربع) است.
خط‌کشی‌ها 9 میلی‌متر مربع را پوشش می‌دهند. خطوط مرزی (خط‌کشی‌های Neubauer)، خطوط مرکزی گروه‌های خطوط سه تایی هستند.
خطوط 1 میلی‌متر مربعی وسط به گروه‌های با 16 مربع کوچک خط‌کشی می‌شوند و هر گروه با خطوط سه گانه که خط وسط آن مرز گروه است از هم جدا می‌شود.
سطح خط‌کشی شده 0.02 میلی‌متر زیر شیشه پوشش است که حجم روی بخش یک میلی‌متر مربع را به بیش از 0.02 میلی‌متر مکعب (میلی‌متر مکعب) می‌رساند. تمام سلول‌ها در این میلی متر مربع شمارش می‌شوند.
تعداد سلول‌هایی را که میخواهیم شمارش کنیم به صورت زیر محاسبه می‌شود:
تعداد سلول در میلی‌متر = تعداد سلول‌های شمارش شده * رقت * 50000
[ضریب 50000 برای تعیین تعداد سلول در 1 میلی‌لیتر استفاده می‌شود: 1 میلی‌لیتر = 1000 میلی‌متر مکعب = (50 برابر عمق 0.02 میلی‌متری محفظه) * 1000.]انواع مختلفی از روش‌های شمارش میکروسکوپی مستقیم برای مشاهده و اندازه‌گیری رشد باکتری‌ها در محیط‌های طبیعی استفاده شده است. به منظور تشخیص و اثبات این‌که باکتری‌های گرمادوست (Thermophilic) در چشمه‌های آب گرم رشد می‌کنند، T.D. Brock لام‌های میکروسکوپی را در چشمه‌ها غوطه‌ور کرد و آن‌ها را به صورت دوره‌ای برای مشاهده میکروسکوپی بیرون کشید. باکتری‌های موجود در آب جوش به طور طبیعی به لام شیشه‌ای چسبیده بودند و به صورت میکروکلونی‌هایی روی سطح آن رشد کردند.
مزایای شمارش میکروسکوپی مستقیم
- روشی سریع، ساده و آسان بوده که نیاز به حداقل تجهیزات دارد.
- مورفولوژی باکتری‌ها را می‌توان با شمارش آن‌ها مشاهده کرد.
- سوسپانسیون‌های بسیار متراکم را می‌توان در صورت رقیق شدن به طور مناسب، شمارش کرد.
محدودیت‌های شمارش میکروسکوپی مستقیم
- اگر چه سریع است، اما شمارش مستقیم دارای معایبی است که در آن هم سلول‌های زنده و هم سلول‌های مرده شمارش می‌شوند.
- فقط سوسپانسیون‌های متراکم را می‌توان شمارش کرد (بیش از 107 سلول در هر میلی‌لیتر)، اما نمونه‌ها را می‌توان با سانتریفیوژ یا فیلتراسیون برای افزایش حساسیت تغلیظ کرد.
- به جمعیت‌های کمتر از 1 میلیون سلول حساس نیست.
- مشاهده سلول‌های کوچک در زیر میکروسکوپ دشوار است و احتمالاً برخی از سلول‌ها در شمارش از قلم می‌افتند.
- دستیابی به دقت دشوار است.
- هنگامی که نمونه رنگ‌آمیزی نشده باشد، میکروسکوپ کنتراست فاز (Phase contrast microscope) مورد نیاز است.
همچنین بخوانید:
مترجم: صادق حسینی‌کیا
