مقدمه‌ای بر طراحی سیستم های ZFNs
اولین ZFN ها به عنوان اندونوکلئازهای محدود کننده کایمریک ایجاد شدند و نشان داده شد که فعالیت در شرایط آزمایشگاهی دارند. مشخص نبود که دمین برش پروکاریوتی بتواند بر روی DNA مونتاژ شده در کروماتین عمل کند، اما آزمایش‌ها در تخمک‌های Xenopus با یک بستر مصنوعی، خارج کروموزومی و ZFNهایی با ویژگی شناخته شده، کارایی بسیار بالایی از شکاف و نوترکیب را نشان دادند.
اولین موفقیت با یک جفت ZFN که de novo برای یک هدف ژنومی طراحی شده بود در مگس سرکه رخ داد. از آن زمان، جفت‌های ZFN طراحی، ساخته شده و با موفقیت برای ژن‌های فردی در ارگانیسم‌ها و انواع سلولی بسیار متنوعی استفاده شده‌اند.
کلید این موفقیت ها روش هایی برای تحویل ZFN ها و در صورت تمایل، DNA دهنده بوده است. در سلول های کشت شده، سازه های بیانی برای ZFN ها از پروموترهای مناسب با نوع سلول و ناقل هایی استفاده می کنند که می توانند با ترانسفکشن DNA یا عفونت توسط ویروس ها معرفی شوند.
همین روش ها برای معرفی اهداکننده نیز مفید است. در مگس سرکه، آزمایش‌های اولیه بر ادغام ژنومی توالی‌های کدکننده ZFN و DNA دهنده از طریق تبدیل با واسطه‌ی عنصر P متکی بود. این امر مستلزم ساخت سویه نسبتا دقیقی بود و زمانی که نشان داده شد که کارایی عالی رویدادهای همولوگ و غیرهمولوگ را می توان با تزریق mRNA های ZFN و DNA دهنده به جنین ها به دست آورد، موفقیت خوبی رخ داد.
مطالعات مختلف همچنین برخی از چالش های ارائه مواد هدف را نشان داده اند. آزمایشات اولیه با Caenorhabditis elegans سطوح بالایی از جهش زایی سوماتیک را در اهداف هم در ژنوم و هم در آرایه های خارج کروموزومی با استفاده از یک پروموتر شوک حرارتی برای هدایت بیان ZFN از یک الگوی DNA به دست آورد. جهش زایی با هدف ZFN در بسیاری از موارد به دست آمده است، اما جایگزینی ژن در همه آنها اتفاق نیفتاده است.
در اکثر سیستم های هدف گیری، تلاش کمی برای درک جزئیات و دستکاری فرآیندهای مولکولی ترمیم DNA انجام شده است. به نظر می رسد بسیار محتمل است که فرآیندهای استاندارد نوترکیبی همولوگ و اتصال انتهایی غیرهمولوگ در بیشتر موقعیت ها عمل کنند، اما ممکن است تغییرات مهم و اجزای تخصصی وجود داشته باشد که می توانند تنظیم شوند.
تا اینجا به نظر می رسد که مسیری هموار از طراحی ZFN تا تغییرات ژنتیکی هدفمند وجود دارد. در واقع، بخش قابل توجهی از جفت‌های ZFN، چه با طراحی یا انتخاب تولید شوند، شکست می‌خورند. حتی دانشمندان در Sangamo Biosciences و Sigma-Aldrich که به بزرگترین و بهترین آرشیو از ZFها دسترسی دارند، چندین جفت را برای توالی‌های درون یک ژن هدف ایجاد کرده و آنها را به طور گسترده آزمایش می‌کنند.
در برخی موارد می توان انگشتان را به عنوان ماژول های مستقل در نظر گرفت و آنها را در ترکیبات جدید برای اهداف جدید جمع کرد. با این حال، تأثیرات ظریف زمینه می تواند این رویکرد را شکست دهد. روش‌هایی برای انتخاب مجموعه‌های سه انگشتی جدید از کتابخانه‌های نیمه تصادفی ایجاد شده‌اند، اما می‌تواند کاملا زمان‌بر باشند.
موضوع دیگر، تمایل یک مجموعه ZF خاص است. حداقل سه انگشت در هر ZFN برای ایجاد تمایل مناسب لازم است، اما همه انگشتان به یک اندازه مشارکت ندارند. انگشتان بیشتری را می توان اضافه کرد و نمونه هایی تا شش انگشت استفاده شده است. همچنین ممکن است که برخی از مناطق ژنومی، حتی توالی های خاص در یک ژن، به دلیل ساختار کروماتین فشرده، اصلاح DNA یا عوامل دیگر غیرقابل دسترسی باشند.
ارزیابی این موضوع در بسیاری از موقعیت‌ها دشوار است و به طور تجربی برای هیچ هدف ZFN مورد بررسی قرار نگرفته است. این امکان وجود دارد که برش ZFN تا حد زیادی در مرحله S چرخه سلولی رخ دهد، زمانی که تمام توالی های ژنومی برای همانندسازی در معرض قرار می گیرند. آزمایش‌ها با ZFNها در سلول‌های غیرقابل تقسیم در این زمینه بسیار آموزنده خواهد بود. از بسیاری جهات، ما خوش شانس هستیم که چارچوب ZF از عوامل رونویسی طبیعی ناشی می شود که باید اهداف خود را در یک زمینه کروماتین پیدا کنند.
ویژگی اتصال ZF چالش دیگری است. برخی از انگشتان به طور مساوی متصل می شوند و حتی بهترین انگشتان نیز تمایل زیادی به دنباله های مرتبط دارند. افزودن انگشتان می‌تواند ویژگی و همچنین تمایل را بهبود بخشد، اما این احتمال نیز وجود دارد که زیرمجموعه‌های انگشتان در یک دامنه polydactyl واسطه اتصال به مکان‌های خارج از هدف باشند. نشان داده شده است که جداسازی ماژول های دو انگشتی با یک پیوند دهنده بسیار کوتاه باعث بهبود ویژگی می شود و این رویکردی است که به طور معمول توسط Sangamo و Sigma-Aldrich استفاده می شود.
هنگامی که ZFN ها برای استفاده در ژن درمانی انسان در نظر گرفته می شوند، باید مراقبت های بسیار بیشتری برای جلوگیری از تغییرات ناخواسته ژنوم مضر انجام شود. ZFN های مورد استفاده در یک کارآزمایی بالینی کنونی انتخاب، پالایش و به طور گسترده آزمایش شده اند. با این حال، تجزیه و تحلیل مستقیم از جایی که برش های خارج از هدف اتفاق می افتد، حتی در سطوح بسیار پایین مفید خواهد بود.
چشم انداز هدف گذاری ژن مبتنی بر ZFN
در اصل، هر ژن در هر ارگانیسمی را می توان با یک جفت ZFN که به درستی طراحی شده است، هدف قرار داد. تشخیص انگشت روی تنها به تطابق با توالی DNA بستگی دارد و مکانیسم‌های ترمیم DNA، هم نوترکیبی همولوگ و هم اتصال انتهایی غیرهمولوگ، اساسا در همه گونه‌ها مشترک است.
همانطور که در بالا ذکر شد، روش‌های تحویل موثر ZFNs و DNA اهداکننده در بین کاربردها متفاوت است و تغییرات بیولوژیکی در، در دسترس بودن مسیرهای ترمیم DNA خاص ممکن است بر نتیجه تأثیر بگذارد. با این وجود، به نظر می رسد بسیار محتمل است که هدف گیری مبتنی بر ZFN در آینده برای ارگانیسم های دیگر، از جمله ارگانیسم هایی که اهمیت اقتصادی و پزشکی دارند، اعمال شود.
در میان موجودات تجربی، فناوری ZFN بیشترین تأثیر خود را بر روی گونه‌هایی دارد که قبلا هیچ روش مؤثری برای هدف‌گیری ژنی نداشتند. کاربرد ZFNs در گیاهان زراعی تغییراتی را در مکان ژنومی طبیعی ایجاد می کند که ممکن است برای مصرف کنندگان قابل قبول تر از سویه های اصلاح شده ژنتیکی با افزودن ژن باشد.
درمان های آینده مبتنی بر کشت و پیوند به راحتی قابل تصور است. سلول های بنیادی خونساز به خوبی برای این رویکرد مناسب هستند. سایر سلول‌های پیش‌ساز (برای مثال سلول‌های بنیادی پرتوان القایی انسان ES) نیز پس از مشخص شدن کامل و آشکار شدن الزامات آنها برای تمایز مناسب، کاندیدهای عالی هستند. چشم انداز درمان هایی که نیازمند تحویل ZFN ها و شاید DNA دهنده به بافت های دست نخورده هستند، دورتر به نظر می رسند، به خصوص اگر اثربخشی به اصلاح بخش قابل توجهی از سلول های آسیب دیده نیاز داشته باشد.
