اطلاعات عمومی, ویکی ژن
طراحی پنل چند رنگ در فلوسایتومتری
مقدمه‌ای بر طراحی پنل چند رنگ در فلوسایتومتری
طراحی پنل چند رنگ در فلوسایتومتری شامل استفاده از رنگ های فلورسنت متعددی است که نشانگرهای زیستی خاص یا اجزای سلولی را هدف قرار می دهند. هر رنگ هنگام برانگیختگی لیزر در طول موج خاصی نور ساطع می کند و شدت نور ساطع شده متناسب با مقدار بیومارکر هدف در سلول است.
هنگام طراحی یک پنل چند رنگ برای فلوسایتومتری، عوامل مختلفی باید در نظر گرفته شود. اینها شامل پیکربندی دستگاه، در دسترس بودن فلوروکرومهای سازگار، روشنایی و پایداری رنگها، همپوشانی طیفی بین فلوروکرومهای مختلف و ارتباط بیولوژیکی نشانگرهای مورد تجزیه و تحلیل است.
در فلوسایتومتری، پیکربندی نوری دستگاه نقش مهمی در طراحی و تجزیه و تحلیل پنل های چند رنگ ایفا می کند. پنل های چند رنگ، که از چندین نشانگر فلورسنت برای تجزیه و تحلیل همزمان پارامترهای سلولی مختلف استفاده می کنند، به دلیل توانایی آنها در ارائه اطلاعات جامع تر در مورد جمعیت های سلولی، در فلوسایتومتری محبوبیت فزاینده ای پیدا کرده اند. پیکربندی نوری دستگاه فلوسایتومتری به شدت بر تنوع قابل انتخاب و دقت نتایج این پنل های چند رنگ تأثیر می گذارد.
یکی از ملاحظات کلیدی هنگام طراحی یک پنل چند رنگ، انتخاب فلوروفورهایی است که برای برچسب گذاری اجزای مختلف سلولی استفاده می شود. هر فلوروفور دارای طیف‌های تحریک و انتشار منحصربه‌فردی است و فیلترها و آشکارسازهای نوری در ابزار فلوسایتومتری باید با دقت انتخاب شوند تا از تشخیص مناسب هر سیگنال فلورسنت اطمینان حاصل شود. پیکربندی نوری دستگاه شامل اجزایی مانند لیزر، آینه های دو رنگ، فیلترهای بندپس و آشکارسازها است که همگی در به حداکثر رساندن حساسیت و وضوح دستگاه نقش دارند.
تعداد و نوع لیزرهای موجود در دستگاه، فاکتورهای مهمی است که باید در طراحی یک پنل چند رنگ در نظر گرفت. فلوروفورهای مختلف به طول موج های تحریک خاصی نیاز دارند و داشتن لیزرهای متعدد با قابلیت های تحریک متفاوت امکان تشخیص همزمان سیگنال های فلورسنت متعدد را فراهم می کند. علاوه بر این، قدرت و پایداری لیزرها بر نسبت سیگنال به نویز و حساسیت کلی دستگاه تأثیر می‌گذارد.
آینه های دو رنگ و فیلترها از اجزای ضروری سیستم نوری هستند که به جداسازی و هدایت سیگنال های فلورسنت به آشکارسازهای مناسب کمک می کنند. آینه های دو رنگ به طور انتخابی طول موج های خاصی از نور را منعکس یا منتقل می کنند، در حالی که فیلترها برای جداسازی سیگنال فلورسانس ساطع شده از نویز پس زمینه استفاده می شوند. انتخاب و تراز مناسب این اجزای نوری برای به حداقل رساندن همپوشانی طیفی و تداخل بین فلوروفورها در یک پنل چند رنگ بسیار مهم است.
آشکارسازها در ابزار فلوسایتومتری سیگنال های فلورسانس ساطع شده را به سیگنال های الکترونیکی تبدیل می کنند که قابل اندازه گیری و تجزیه و تحلیل هستند. حساسیت و دامنه دینامیکی آشکارسازها بر توانایی دستگاه برای تشخیص دقیق و کمیت سیگنال های فلورسنت از فلوروفورهای مختلف تأثیر می گذارد.
وضوح آشکارساز و خطی بودن نیز ملاحظات مهمی در هنگام طراحی پنل های چند رنگ برای اطمینان از اندازه گیری های دقیق و قابل تکرار هستند.
برای ایجاد یک پنل چند رنگ موثر، محققان باید فلوروکروم هایی را انتخاب کنند که روشن و پایدار باشند و حداقل همپوشانی طیفی بین آنها وجود داشته باشد تا از سرریز سیگنال جلوگیری شود و از اندازه گیری های دقیق اطمینان حاصل شود. آنها همچنین باید زمینه بیولوژیکی آزمایش را در نظر بگیرند و نشانگرهایی را انتخاب کنند که اطلاعات مربوط به سلول های مورد تجزیه و تحلیل را ارائه می دهند.
یکی از رویکردهای رایج برای طراحی یک پنل چند رنگ استفاده از ترکیبی از فلوروکروم هایی است که طیف وسیعی از طیف نور مرئی را پوشش می دهد. به عنوان مثال، محققان ممکن است رنگ هایی را انتخاب کنند که نور را در طول موج های مختلف ساطع می کنند، مانند فلورسئین ایزوتیوسیانات، فیکواریترین، آلوفیکوسیانین و برلیانت ویولت 421). با ترکیب این رنگ ها در ترکیب های مختلف، محققان می توانند چندین نشانگر را به طور همزمان تجزیه و تحلیل کنند و درک جامع تری از جمعیت های سلولی مورد مطالعه به دست آورند.
یکی دیگر از نکات مهم در طراحی پنل های چند رنگ، گنجاندن کنترل ها و بیدهای جبران همپوشانی مناسب برای اطمینان از دقت و تکرارپذیری اندازه گیری ها است. کنترل‌ها به محققان کمک می‌کنند استراتژی‌های گیتینگ را ایجاد کنند و مقادیر جبرانی را برای تصحیح همپوشانی طیفی بین فلوروکروم‌ها تنظیم کنند، در حالی که دانه‌های جبرانی کالیبراسیون فلوسایتومتر را برای تعیین کمیت دقیق سیگنال‌های فلورسانس امکان‌پذیر می‌کنند.
بیایید نمونه ای از یک پنل چند رنگی با طراحی خوب برای فلوسایتومتری را بررسی کنیم:
در آزمایش فرضی خود، ما علاقه مند به مطالعه جمعیت سلول های ایمنی در یک نمونه خون هستیم. ما می خواهیم به طور همزمان سطوح بیان نشانگرهای CD3، CD4، CD8، CD19 و CD56 را بر روی لنفوسیت ها تجزیه و تحلیل کنیم. برای رسیدن به این هدف، ما یک پنل 5 رنگ با استفاده از فلوروکروم های زیر طراحی می کنیم FITC، PE، PerCP-Cy5.5، PE-Cy7 و APC
اولین قدم در طراحی پنل ما در نظر گرفتن خواص طیفی هر فلوروکروم است. ما باید اطمینان حاصل کنیم که طیف انتشار فلوروکروم‌ها با هم همپوشانی ندارند، زیرا این امر می‌تواند منجر به سرریز سیگنال و اندازه‌گیری‌های نادرست شود. با ترسیم ماتریس های همپوشانی طیفی و نمودارهای طیف گسیل فلورسانس، می توانیم فلوروکروم هایی را با حداقل همپوشانی طیفی برای نشانگرهای مورد علاقه خود انتخاب کنیم.
در پنل خود، فلوروکروم های زیر را به نشانگرهای خود اختصاص می دهیم:
- CD3: FITC
- CD4: PE
- CD8: PerCP-Cy5.5
- CD19: PE-Cy7
- CD56: APC
با انتخاب دقیق فلوروکروم‌ها با طیف‌های انتشار متمایز، پتانسیل سرریز را به حداقل می‌رسانیم و از اندازه‌گیری دقیق هر نشانگر اطمینان می‌دهیم.
در طراحی پنل نهایی باید کنترل های جبران همپوشانی فلوسایتومتری برای محاسبه همپوشانی طیفی و تنظیم مقادیر جبران را در نظر گرفت. با اجرای کنترل‌های تک رنگ و فلورسانس منهای یک (FMO)، می‌توانیم تنظیمات جبران‌سازی و گیتینگ خود را نیز به صورت دقیق تنظیم کنیم.
همچنین بخوانید:
