طیف سنجی UV-Vis: اصول، قطعات، موارد استفاده، محدودیت‌ها

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر طیف سنجی UV-Vis

طیف سنجی UV-Vis یا طیف سنجی مرئی فرابنفش یا طیف سنجی مرئی ماوراء بنفش (UV-Vis) همچنین طیف سنجی جذبی یا طیف‌سنجی بازتابی در ناحیه طیفی مرئی فرابنفش نامیده می‌شود.

انتقال الکترون صورت می‌گیرد، بنابراین به آن طیف سنجی الکترونی نیز می‌گویند. این یک تکنیک مقرون به صرفه، ساده، همه کاره و غیر مخرب است که به نمونه اجازه می‌دهد تا دوباره برای تجزیه و تحلیل بیشتر استفاده شود. این یک تکنیک کیفی، کمی و تحلیلی است که یک نمونه را با یک نمونه خالی یا مرجع مقایسه می‌کند. این مقایسه یه منظور اندازه‌گیری مقدار نور مجزای فرابنفش و مرئی جذب یا منتقل شده از طریق یک نمونه خاص را با استفاده از قانون بیر-لامبرت در شرایط انجام می‌گیرد.

طول موج طیف سنجی UV-vis از 190 نانومتر تا 800 نانومتر متغیر است. محدوده UV بین 190 تا 400 نانومتر و ناحیه مرئی بین 400 تا 800 نانومتر می‌باشد. ناحیه نزدیک UV 190 نانومتر تا 400 نانومتر است و ناحیه UV دور زیر 200 نانومتر است. هر چه طول موج کوتاه‌تر باشد فرکانس و انرژی بیشتر خواهد بود. به طور مشابه، هر چه طول موج بیشتر باشد، فرکانس و انرژی در ناحیه مرئی کمتر است.

کارکرد آن به ترکیب و غلظت نمونه بستگی دارد. با تجزیه و تحلیل الگوی جذب و انتقال نور، به شناسایی، ارزیابی خلوص و تعیین کمیت اجزای نمونه کمک می‌کند. ممکن است در چندین نوع نمونه مانند جامدات یکپارچه، مایعات، شیشه، پودرها و لایه‌های نازک کاربرد داشته باشد.

جذب (A): به عنوان چگالی نوری (OD) نیز شناخته می‌شود، مقدار نور جذب شده توسط جسم است و می‌تواند به صورت زیر بیان شود:

جذب (A)= -log(T)

گذرا (T): با تقسیم طیف شدت نور عبوری از یک نمونه (I) بر طیف شدت نور عبوری از قسمت خالی (I0) اندازه گیری می‌شود.

T= I/Io

اصل طیف سنجی UV-Vis

وقتی طول موج خاصی از نور به یک مولکول برخورد می‌کند، آن مولکول برانگیخته می‌شود. هنگامی که الکترون برانگیخته می‌شود، از حالت انرژی پایین‌تر به حالت انرژی بالاتر برانگیخته می‌گردد. هنگامی که یک الکترون از زمین می‌پرد، انرژی نور را جذب می‌کند زیرا الکترون‌های موجود در اوربیتال در حالت انرژی پایین‌تر از انرژی برای حرکت به سطح انرژی بالاتر استفاده می‌کنند.

انرژی نه ایجاد می‌شود و نه از بین می‌رود بلکه می‌تواند انرژی را از شکلی به شکل دیگر تبدیل کرد. با عبور از EMR (محدوده UV- Vis 200-800 نانومتر)، فقط نوری که دارای مقدار دقیق انرژی است که می‌تواند باعث انتقال از یک سطح به سطح دیگر شود. این انرژی جذب می‌شود زیرا سطوح انرژی ماده کوانتیزه می‌گردد.

اگر انرژی مورد استفاده قرار گیرد، شدت نور دریافتی از بین می‌رود. در این زمان، انرژی جذب شده توسط الکترون‌ها برابر با اختلاف انرژی بین دو سطح انرژی خواهد بود.

در این مرحله، انتقال الکترون رخ می‌دهد. بنابراین پس از برهمکنش تابش الکترومغناطیس، طیف‌های دریافتی را طیف جذبی می‌نامند. از این رو به آن طیف سنجی الکترونی می‌گویند. به طور مشابه، هنگامی که الکترون‌های موجود در اوربیتال در سطح انرژی بالاتر به سطح انرژی زمین حرکت می‌کنند، طیف‌های دریافتی گسیل نامیده می‌شوند.

معادله قانون بیر-لامبرت اصلی است که پشت طیف سنجی جذب است.

غلظت نمونه را می‌توان مستقیماً از روی جذب طیف‌های تولید شده توسط این نمونه‌ها در طول موج‌های خاص با استفاده از قانون بیر-لامبرت تعیین کرد.

قانون بیر-لامبرت چیست؟

هنگامی که به یک پرتو نور اجازه عبور از یک محیط شفاف داده می‌شود، ضخامت متوسط مستقیماً با شدت پرتو نور متناسب است.

طبق قانون بیر-لامبرت، جذب با غلظت ماده در محلول نسبت مستقیم دارد. بنابراین، غلظت نمونه را می‌توان با استفاده از طیف سنجی مرئی UV نیز تعیین کرد.

قانون بیر-لامبرت را می‌توان به صورت معادله زیر بیان کرد:

A = –log T = –log (I ⁄ Io ) = log (Io ⁄ I) = ecl

A = ecl

A = جذب

L = طول مسیر نوری سلول یا کووت یا نگهدارنده نمونه (سانتی متر)

C = غلظت محلول (mol dm-3)

E = جذب مولی ترکیب یا مولکول در محلول، که برای یک ماده خاص در یک طول موج خاص (dm3 mol-1 cm-1) ثابت است.

با پیروی از قانون بیر-لامبرت، اگر جذب مجموعه‌ای از محلول‌های نمونه با غلظت‌های شناخته شده اندازه‌گیری و براساس غلظت‌های معادل ترسیم شود، نمودار جذب در مقابل غلظت باید خطی باشد. این نمودار به عنوان گراف کالیبراسیون شناخته می‌شود.

اجزا و قطعات طیف سنجی UV-Vis

اجزای اصلی اسپکتروفتومتر UV-Vis عبارتند از:

منبع نور
انتخابگر طول موج
ظرف نمونه
آشکارسازها

منبع نور

برای تابش نور در طیف گسترده‌ای از طول موج‌ها برای کار با طیف سنج UV-Vis ضروری است. معمولاً یک منبع نور با شدت بالا که برای هر دو محدوده UV و Visible استفاده می‌شود، لامپ زنون مورد استفاده است.

برخلاف لامپ‌های تنگستن و هالوژن، پایداری کمتر و هزینه بیشتری دارد. بنابراین، دو لامپ این ابزار یک لامپ دوتریوم برای نور UV و یک لامپ هالوژن یا تنگستن برای نور مرئی به عنوان منبع نور هستند. دو لامپ شدت خوبی دارند. در حین اندازه‌گیری شدت نور، طیف سنج باید تغییر کند. هنگامی که تغییر بین 300 تا 350 نانومتر اتفاق می‌افتد، انتقال نرم‌تر امکان‌پذیر است. زیرا انتشار نور برای هر دو منبع نور مرئی و UV همان مقدار نور در آن طول موج است.

انتخابگر طول موج

به منظور امکان بررسی نمونه با استفاده از طول موج‌هایی که منبع نور ساطع می‌کند، انتخاب طول موج کمک می‌کند تا مشخص شود کدام طول موج برای نوع آنالیت و نمونه مناسب است. انتخابگر طول موج متداول در طیف سنج UV-Vis تک رنگ است. نور را به یک نوار باریک از طول موج جدا می‌کند.

از شکاف ورودی، تابش طول موج‌های مختلف وارد تک رنگ می‌شود. در یک زاویه خاص، پرتو به عنصر پراکنده برخورد می‌کند. یک تک رنگ دارای منشوری است که تمام طول موج‌های مختلف نور را در یک پرتو جدا می‌کند. نور تک رنگ را خم کرده و پراکندگی غیرخطی ایجاد می‌کند. تنها یک تشعشع یا رنگ با طول موج خاص به آن اجازه می‌دهد تا تکرنگ‌ساز را ترک کرده و از زنجیره نهایی یا شکاف خروجی خود عبور کند.

ظرف نمونه

در یک اسپکتروفتومتر تک پرتو، تمام تابش حاصل از منبع نور به صورت یک پرتو از نمونه عبور می‌کند. اسپکتروفتومترهای تک پرتو می‌توانند رنگ را با مقایسه شدت منابع نور قبل و بعد از قرار دادن نمونه تعیین کنند. اندازه‌گیری محدوده طول موج 190-750 نانومتر است. با این حال، ممکن است تا 1100 نانومتر برود.

در یک اسپکتروفتومتر دو پرتو، تمام تابش حاصل از منبع نور به دو پرتو تقسیم می‌شود: یکی از نمونه عبور می‌کند و دیگری فقط از مرجع عبور می‌کند. به طور مشابه، اسپکتروفتومترهای دو پرتو محدوده طول موج 190 تا 1100 نانومتر را ارائه می‌دهند. علاوه بر این، اسپکتروفتومتر دو پرتو جذب را در مقابل طول موج یا نسبت پرتو نمونه و مرجع اندازه‌گیری می‌کند.

آشکارساز مرجع برای تنظیم نوسانات روشنایی لامپ برای هر اندازه‌گیری استفاده می‌شود. پس از جمع آوری نمونه، آشکارساز نمونه در موقعیت نمونه اندازه‌گیری شده و از طیف نمونه کسر می‌شود. این شامل یک اتاق مرجع و یک اتاق نمونه است. نمونه در یک ظرف صاف و شفاف به نام کووت یا محفظه نمونه نگهداری می‌شود. حلالی که نمونه در آن حل می‌شود در محفظه مرجع نگهداری می‌شود که به آن بلانک نیز می‌گویند. انتخاب سلول نمونه به طول مسیر، شکل، اندازه و ویژگی‌های انتقال در طول موج مورد نظر و هزینه نسبی بستگی دارد.

برای هر طول موج، شدت نور از طریق جداکننده پرتو از محفظه مرجع (Io) و محفظه نمونه (I) می‌گذرد. شدت نور به عنوان نمادی است که Io تعداد فوتون‌ها را در ثانیه اندازه می‌گیرد. هنگامی که نور از محلول خالی عبور می‌کند، نور را جذب نمی‌کند که به آن (l) گفته می‌شود. اگر نمونه I کمتر از Io باشد، نمونه مقداری نور جذب کرده است.

جذب (A) نمونه با توجه به معادله زیر به I و Io مربوط می‌شود:

جذب (A)= -log(T)= -log (I/Io)

این معادله روابط بین جذب و انتقال را نشان می‌دهد.

همچنین، کسری که بر Io تقسیم می‌کنم، عبور (T) نامیده می‌شود که بیانگر مقدار نوری است که از یک نمونه عبور کرده است.

T= I/Io

T= I/Io = e–kbc

I o شدت عبور است
I شدت انتقال است
E پایه لگاریتم‌های طبیعی است
K یک ثابت است
B طول مسیر است (معمولا بر حسب سانتی متر)

هرچه انکسار سبک‌تر باشد، گذرندگی بیشتری رخ می‌دهد. هر چه میزان جذب کمتر باشد، ضریب انتقال بیشتر است.

در نواحی اشعه ماوراء بنفش و مرئی، معمولاً از کووت‌های سیلیس ذوب شده یا کوارتز استفاده می‌شود.

آشکارساز

آشکارسازها بر روی پوشش‌های فوتوالکتریک یا نیمه هادی‌ها متکی هستند. نور ورودی از نمونه را به سیگنال یا جریان الکتریکی تبدیل می‌کند. هر چه جریان بیشتر باشد، شدت آن بیشتر می‌شود. این ویژگی نویز کم و حساسیت بالا دارد، بنابراین پاسخ خطی می‌دهد. هر آشکارساز دارای طیف‌های مختلف طول موج و حساسیت‌های متفاوت است. در نهایت، ضبط کننده داده معمولاً جذب را در برابر طول موج (nm) در بخش UV و مرئی طیف الکترومغناطیسی ترسیم می‌کند.

کاربردهای طیف سنجی UV-Vis

تجزیه و تحلیل DNA و RNA

تمرکز آن بر تایید غلظت و خلوص DNA و RNA است که نقش مهمی در کاربردهای پایین دستی مانند توالی‌یابی دارد. این اطمینان را می‌دهد که آیا نمونه‌های DNA یا RNA آماده شده برای توالی‌یابی آلوده‌اند یا خالص هستند.

از آنجایی که DNA خالص دارای نسبت جذب 1.8 و RNA خالص دارای نسبت 2 است، نسبت جذب 260 نانومتر به 280 نانومتر برای نمایش آلودگی پروتئین در اسیدهای نوکلئیک بسیار مهم است. نسبت جذب 260nm/230nm برای RNA و DNA متفاوت است (2.15 تا 2.50).

تجزیه و تحلیل دارویی

در کشف و توسعه دارو، تعیین کمیت ناخالصی‌ها در مواد تشکیل دهنده دارو، آزمایش انحلال اشکال خوراکی جامد مانند قرص‌ها، و شناسایی و تعیین کمیت شیمیایی ضروری است. با استفاده از مشتقات ریاضی برای شناسایی ترکیبات دارویی امکان همپوشانی پیک‌های جذب در طیف اصلی را فراهم می‌کند.

به همین ترتیب، برای شناسایی ترکیبات دارویی، کلرتتراسایکلین (آنتی‌بیوتیک) و بنزوکائین (بی‌حس کننده) در فرمولاسیون پودر دامپزشکی، با همپوشانی پیک جذب در طیف UV با استفاده از مشتقات ریاضی مورد استفاده است.

برنامه‌های غذایی و آشامیدنی

این برای ارزیابی ویژگی‌های حسی، اجزای تغذیه‌ای غذا و محصولات آن مانند آبجو، شراب، آب میوه، انرژی‌زاها و نوشابه، آب، سایر مایعات رقیق و مایعات غلیظ (عسل، روغن)، میوه‌ها، سبزیجات، مواد کافئین‌دار و غیره کاربرد دارد. همچنین به شناسایی ترکیب شیمیایی مواد تشکیل دهنده و شناسایی آلاینده‌ها یا مواد تقلبی برای اطمینان از ایمن و سالم بودن محصول می‌پردازد.

با شناسایی آنتوسیانین موجود در زغال اخته، تمشک و گیلاس می‌توان از آن در کنترل کیفیت شراب استفاده کرد. می‌تواند رنگ، طعم و عطر غذا و محصول غذایی را ارزیابی کند.

کشت باکتری

در منحنی رشد زیست توده ضروری است. در کشت باکتری‌ها با تخمین غلظت سلولی و ردیابی رشد در اندازه‌گیری چگالی نوری در 600 نانومتر استفاده می‌شود. 600 نانومتر برای حفظ خواص نوری محیط کشت که در آن باکتری‌ها رشد می‌کنند و برای جلوگیری از آسیب سلولی در زمانی که نیاز به آزمایش مداوم وجود دارد، بهترین گزینه است.

سایر کاربردها

در صنعت آرایشی و بهداشتی، از آن برای ارزیابی عوامل پایداری نور و شاخص رنگ، کمی کردن رنگ‌ها و آنتی‌اکسیدان‌ها و تشخیص تقلب استفاده می‌شود.
از آن در علم مواد، مانند تعیین خصوصیات نانوذرات کوچک و برای تعیین ترکیب باتری استفاده می‌شود.
برای بررسی تغییرات ساختاری پروتئین با ردیابی تغییرات در حداکثر جذب طول موج استفاده می‌شود.
در تصفیه فاضلاب، از آن در مطالعات سینتیکی و نظارت بر رنگ‌ها و محصولات جانبی رنگ استفاده می‌شود تا از حذف کافی رنگ با مقایسه طیف‌های آن‌ها در طول زمان اطمینان حاصل شود.
در تحقیقات سرطان برای تخمین غلظت هموگلوبین استفاده می‌شود.
از آن برای اندازه‌گیری شاخص رنگ برای نظارت بر روغن ترانسفورماتور به عنوان یک اقدام پیشگیرانه برای اطمینان از تحویل ایمن برق استفاده می‌شود.
در پتروشیمی برای مشخص کردن نفت خام، کیفیت گرانش نفت خام، فرمولاسیون شاخص‌های محتوای معطر و محتوای گوگرد استفاده می‌شود.
در زمینه‌های بیوشیمی و ژنتیکی، از آن برای تعیین کمیت DNA، پروتئین/آنزیم و دناتوره شدن حرارتی پروتئین استفاده می‌شود.

مزایای طیف سنجی UV-Vis

غیر مخرب و قابل استفاده مجدد است
کار با آن آسان است و سریع‌ترین روش برای تفسیر داده‌ها است زیرا خوانش‌های دقیقی را ارائه می‌دهد
این یک تکنیک ارزان قیمت و راحت است

معایب طیف سنجی UV-Vis

ممکن است آماده سازی با استفاده از دستگاه زمان‌بر باشد.
در صورت حفظ نویز الکترونیکی، نور بیرون و سایر آلاینده‌ها، خواندن طیف سنج ممکن است تحت تأثیر قرار گیرد.
دقت اندازه‌گیری دستگاه می‌تواند تحت تأثیر نور سرگردان ناشی از طراحی تجهیزات معیوب باشد، زیرا محدوده خطی بودن و اندازه‌گیری جذب مواد احتمالاً توسط نور سرگردان کاهش می‌یابد.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: شقایق مرتاضی

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه