فلوسایتومتری چند رنگ چیست؟

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر فلوسایتومتری چند رنگ

دانشمندان از فلوسایتومتری چند رنگ برای شناسایی و مشخص کردن زیرجمعیت‌های سلولی هدف با استفاده از نشانگرهای فلورسنت متعدد استفاده می‌کنند.

این فناوری در سال‌های اخیر شاهد توسعه‌های سریعی بوده است که منجر به پیشرفت‌هایی در این روش شده است و آن را به یک تکنیک قوی و قابل اعتماد برای انجام تجزیه و تحلیل سلولی پیچیده با سرعت بالا و کارآمد و دارای قابلیت ارزیابی چندین پارامتر به طور همزمان تبدیل کرده است.

تنها در چند ثانیه، این روش می‌تواند هزاران سلول را بررسی کند. همچنین، مجموعه آنتی بادی‌های بسیار اختصاصی مورد استفاده برای شناسایی مواد به طور مداوم در حال گسترش است. علاوه بر این، ابزارهای پیشرفته‌تر فلوسایتومتری توسعه یافته‌اند که امکان تجزیه و تحلیل همزمان بیش از 20 پارامتر را فراهم می‌کنند. در نتیجه، فلوسایتومتری چند رنگی در پیشبرد پیشرفت تحقیقات در علوم زیستی بسیار مؤثر بوده است.

اصول فلوسایتومتری

فلوسایتومتری جزء اصلی فلوسایتومتری چند رنگ است. در اصل، این روش برای تجزیه و تحلیل همزمان هزاران سلول در چندین پارامتر طراحی شده است و این کار را تنها در چند ثانیه انجام می‌دهد. این فرآیند با قرار دادن نمونه آماده شده در محفظه جریان دستگاه سایتومتری، جایی که وارد یک سیستم سیالیک می‌شود، آغاز می‌شود. در این مرحله از فرآیند تمرکز هیدرودینامیکی برای تفکیک نمونه به اجزای تک سلولی استفاده می‌شود.

در طول این فرآیند، یک جریان کنترل شده در اطراف نمونه وارد می‌شود که آن را به مجرای باریکی وادار می‌کند و سلول ها را وادار به تفکیک می‌کند. پس از این، سلول‌های جدا شده بصورت تک تک از مقابل یک لیزر عبور می‌کنند. در تعامل با لیزر، پراکندگی رو به جلو (FSC) و پراکندگی جانبی (SSC) توسط هر سلول ایجاد می‌شود و توسط دستگاه ضبط می‌شود.

در سلول‌هایی که به‌صورت فلورسنت برچسب‌گذاری شده‌اند، فلوروفور هنگام عبور از مقابل لیزر برانگیخته می‌شود و هنگام بازگشت به حالت اولیه‌اش نور ساطع می‌کند. این نور ساطع شده هنگام عبور از یک سری آینه و فیلتر اندازه گیری می‌شود تا زمانی که به آشکارساز مناسب برای طول موج مورد نظر برسد. این آشکارسازها که به عنوان لوله‌های افزاینده نوری (PMT) شناخته می‌شوند، فلورسانس یک طول موج مشخص و از پیش تعیین‌شده را تشخیص می‌دهند.

برای اینکه فقط طول موج‌های نور مورد نیاز عبور کند، از یک فیلتر نوری (فیلتر دو رنگ) برای جلوگیری از طول موج‌های ناخواسته استفاده می‌شود و به عنوان یک آینه عمل می‌کند که طول موج های خاص نور را به آشکارسازها هدایت می‌کند.

شناسایی با فلوسایتومتری

فلوسایتومتری بر ترکیبی از فلوروفورها و آنتی بادی‌ها به عنوان معرف‌های شناسایی متکی است. فلوروفورها بسته به فلوروفور می‌توانند طول موج های خاصی از نور را از طیف وسیعی جذب و ساطع کنند. این به عنوان طیف جذب و انتشار شناخته می‌شود. در طی فلوسایتومتری، طول موج خاصی از نور توسط فلوروفور جذب می‌شود.

این انرژی نوری به الکترون‌های فلوروفور منتقل می شود و باعث تحریک می‌شود. همانطور که فلوروفور به حالت پایه خود باز می‌گردد، انرژی را به شکل فوتونی با طول موج بلندتر از آنچه که در ابتدا تحریک را القا می‌کرد آزاد می‌کند. اساس فلوسایتومتری چند رنگ متکی به پانل‌های چند رنگ است که نیاز به استفاده از رنگ‌های جفتی دارند. رنگ های جفتی از یک فلوروفور دهنده که ویژگی‌های تحریک را ایجاد می‌کند و یک فلوروفور گیرنده دیگر که ویژگی های انتشار را ایجاد می‌کند تشکیل شده اند.

ممکن است که طیف انتشار فلوروفورها با هم همپوشانی داشته باشند، که می‌تواند باعث مشکلاتی در خواندن داده‌ها شود زیرا همپوشانی می‌تواند یک سیگنال مثبت کاذب ایجاد کند. در آزمایش‌های چند رنگ، این همپوشانی طیفی می‌تواند یک مشکل خاص باشد، به این معنی که باید با “اثر جبران” کنترل شود.” اثر جبران”، با اطمینان از اینکه فلورسانس شناسایی شده از فلوروفور اندازه گیری شده آغاز شده است، احتمال همپوشانی مثبت کاذب را از بین می‌برد.

روش های تشخیص آنتی ژن

دو روش برای تشخیص آنتی ژن در فلوسایتومتری وجود دارد. اولین روش، روش مستقیم است که در آن آنتی بادی اولیه مستقیماً به یک فلوروفور کونژوگه می‌شود. روش دوم روش غیرمستقیم است که در آن آنتی بادی اولیه غیر کونژوگه است و یک آنتی بادی ثانویه کونژوگه با فلوروفور که علیه آنتی بادی اولیه هدایت می‌شود برای تشخیص استفاده می‌شود.

هر روش مزایا و معایبی دارد. با این حال، روش مستقیم به دلیل سهولت نسبی ، بیشتر در آزمایش‌های چند رنگ استفاده می‌شود.

تنظیم آزمایش چند رنگ

ساخت پانل رنگی به عنوان سخت ترین بخش از مجموعه آزمایش چند رنگ در نظر گرفته می‌شود. ابتدا آنتی ژن‌های مورد نظر انتخاب می‌شوند. سپس لیزرهایی که دارای طول موج متناظر با فلوروفورها هستند انتخاب می‌شوند. در مرحله بعد، جمعیت سلولی در نظر گرفته می‌شود. در مواردی که بیان آنتی ژن ناشناخته است و یا جمعیت سلولی کم است، از فلوروفور پرنور (روشن تر) استفاده می‌شود.

جایی که انتظار می رود بیان آنتی ژن بالا ویا جمعیت سلولی بالا باشد، فلوروفور کم نور استفاده می‌شود. پس از این، باید اقداماتی برای به حداقل رساندن همپوشانی طیفی با قربانی کردن فلوئوروکروم‌های روشن برای جلوگیری از همپوشانی و با استفاده از اثر جبران برای کنترل آن انجام شود.

همچنین، کنترل ها باید در تنظیم گنجانده شوند. سلول های رنگ نشده را می توان برای تعیین جمعیت منفی، اندازه سلول و دانه بندی استفاده کرد. نشانگرهای زنده/مرده در جداسازی سلول های سالم مفید هستند. از کنترل‌های مثبت تک رنگ‌آمیزی برای تنظیم جبران استفاده می‌شود و با در نظر گرفتن شدت فلورسانس منهای یک رنگ‌آمیزی، می‌توان جمعیت‌های مثبت را شناسایی کرد.

در نهایت، غلظت آنتی بادی باید با خسته کردن آنتی بادی ها بهینه شود. این به جلوگیری از اتصال غیر اختصاصی یا کاهش حساسیت کمک می کند. به طور کلی، فلوسایتومتری چند رنگ به یک روش قوی و قابل اعتماد برای تجزیه و تحلیل زیر جمعیت های درون یک سلول تبدیل شده است. با پیشرفت‌های فناوری، روش بهبود یافته است و محققان از زمان‌های آزمایش سریع و توانایی تجزیه و تحلیل همزمان بیش از 20 پارامتر در یک زمان سود می‌برند.

همچنین بخوانید: