تاریخچه فلوسایتومتری
فلوسایتومتری بر اساس امپدانس و با استفاده از اصل کولتر برای اولین بار در سال 1953 با شماره ثبت اختراع 2,656,508 در اختیار والاس اچ کولتر در ایالات متحده قرار گرفت. اولین دستگاه مبتنی بر فلورسانس ICP 11 بود که در سال 1968 توسط Wolfgang Göhde از دانشگاه مونستر ساخته شد.
در سال 1968 و 1969 زمانی که توسط توسعه دهنده آلمانی Partec از طریق Phywe AG در گوتینگن تولید شد، به صورت تجاری در دسترس قرار گرفت. در آن زمان، روش‌های سنتی جذب هنوز به طور کلی بر تکنیک‌های فلورسانس ترجیح داده می‌شد.
در سال 1965، مک فولویلر فلوسایتومتر را توسعه داد که پیشرو ابزارهای امروزی شد. به ویژه، او مسئول ایجاد یک جداکننده مبتنی بر حجم سلول الکترونیکی بود. این ابزار می‌توانست سلول‌ها را بر اساس حجم سلول الکترونیکی جدا کند و همچنین از انحراف الکترواستاتیکی برای جداسازی و مرتب‌سازی استفاده می‌کرد.
این میکروفلورومتر جریان لوس آلاموس نام داشت. در سال 1969، شرکت Phywe AG از گوتینگن اولین فلوسایتومتر تجاری را که پیرامون میکروسکوپ فلورسنت زایس ساخته شده بود، تولید کرد.
در سال 1970، سایتومتر تجاری، سیتوگراف، از سیستم لیزر He-Ne در طول موج 633 نانومتر برای پراکندگی استفاده کرد و اولین ابزار تجاری بود که از لیزر استفاده کرد. این ابزار میتواند سلول‌های زنده و مرده را بسته به میزان جذب تریپان بلو جدا کرده و دسته‌بندی کند.
به دنبال آن یک نسخه فلورسانس به نام Cytofluorograph که بیشتر به دستگاهی با لیزر آرگون خنک شده با هوا در 488 نانومتر تبدیل شد.
سایتومتری مبتنی بر فلورسانس قبلاً در آلمانی به عنوان سایتوفتومتری پالس یا impulszytophotometrie شناخته می شد. در سال 1976، هشت سال پس از معرفی اولین فلوسایتومتر مبتنی بر فلورسانس، در کنفرانس بنیاد مهندسی آمریکا در پنساکولا، فلوریدا، توافق شد که نام “فلوسایتومتری” را بتوان استفاده کرد، اصطلاحی که به سرعت رایج شد.
اساس فلوسایتومتری
اندازه گیری خواص ذرات به صورت انفرادی، یکی از اصول بنیادین در فلوسایتومتری است. زمانی که یک نمونه از یک محلول به فلوسایتومتر تزریق می گردد، ذرات بصورت تصادفی در فضای سه بعدی پراکنده می شوند. بر این اساس نمونه باید به جریانی از ذرات مجزا (منفرد) تبدیل شود تا بتواند در معرض سیستم تشخیصی دستگاه قرار گیرد.
این روند به وسیله سیستم سیال انجام می شود. سیستم سیال فلوسایتومتر، دارای یک کانال مرکزی است که نمونه از طریق آن به دستگاه وارد می شود. این کانال مرکزی، به وسیله یک غلاف خارجی که حاوی مایعی با سرعت جریان بسیار بالا است احاطه می شود. سرعت بالای جریان مایع در این غلاف، با اثر کششی که بر نمونه تزریق شده وارد می کند، نقش مهمی در ایجاد یک جریان منفرد سلولی دارد.
به عبارت دیگر تاثیر این سیستم بر روی جریان مایع مرکزی موجب می شود که به صورت سهمی، بیشترین شدت جریان را در مرکـز کانال و جریانی نزدیک به صفــر را در نزدیکـی دیواره های کانال داشته باشیم این پدیده که تمرکز هیدرودینامیک نامیده می شود، موجب ایجاد جریانی از سلول های منفرد در دستگاه فلوسایتومتر می گردد.
پس از تمرکز هیدرودینامیک، هر یک از ذرات، در معرض تشعشع یک یا چند پرتو نوری قرار می گیرند. چنانچه یک آنتی ژن از سطح یا درون سلول، با یک فلوروکروم نشاندار شده باشد، انتشار فلورسانس یا تشعشع نوری ساطع شده از آن، اطالعاتی را در مورد ویژگی های آن ذره (سلول) به ما می دهد. پرتوهای لیزری و لامپ Arc بیشترین منابع نوری هستند که در فلوسایتومتری استفاده می شوند.
لامپ های لیزری، امواجی با طول موج منفرد را در یک یا چند فرکانس تولید میکنند (نور منسجم). لامپ های Arc ارزان تر از لامپ های لیزری هستند و مکانیسم انتشار نور در آن ها از طریق اشتعال گاز محبوس در یک لوله صورت می گیرد. ضمن اینکه لامپ های Arc ،امواجی با چند طول موج متفاوت تولید می کنند.
در نتیجه نور ناشی ازاین لامپ ها ناپایدار و نامنسجم است و در نهایت نیازمند فیلتراسیون است. نوری که در مسیر مستقیم تابیده می شود معمولا حدود 20 درجه از محور تابش لیـزر منحــرف میگردد. لذا این پرتوها به وسیله یک لنز متمرکز شده و دسته پرتوی حاصل شده، کانال مستقیم تابش(FSC) نامیده می شود.
شدت FCS با اندازه ذره متناسب است و می تواند به منظور تشخیص و افتراق بین سلول های مرده و سلول های زنده مورد استفاده قرار گیرد. نوری که در زاویه 90 درجه نسبت به خط برانگیختگی اندازه گیری می شود، اطلاعاتی در زمینه محتوای گرانولی ذره را به ما ارائه می دهد. اندازه گیری فلورسانس که در طول موج های مختلف انجام می شود، میتواند اطلاعات کیفی و کمی را در مورد گیرنده های سطح سلول که با فلوروکروم نشاندار شده اند و همچنین مولکول‌های درون سلولی مانند DNA و ستیوکین‌ها در اختیار ما قرار دهند.
فلوسایتومترها برای تشخیص نوری که تابش شده، از کانال های فلورسانس مجزا استفاده میکنند. تعداد دتکتورها بر اساس نوع دستگاه و کارخانه سازنده آن متفاوت است. همچنین این دتکتورها ممکن است از نوع فوتودیودهای سیلیکونی یا فوتومالتی پلایر باشند. فوتودیودهای سیلیکونی معمولا زمانی که سیگنال قوی باشد و به منظور سنجش تابش مستقیم، به کار گرفته می شوند.
فوتومالتی پلایرها تجهیزاتی حساس تر بوده و به منظور سنجش فلورسانس پراکنده مورد استفاده قرار می گیرند. ویژگی و اختصاصی بودن تشخیص به وسیله فیلترهای اپیتکی کنترل می شود.
این فیلترها از عبور طول موج های خاصی جلوگیری کرده و فقط طول موج های مورد نظر را عبور می دهند. معمولا فیلترها را بر حسب طول موجی که از خود عبور می دهند به سه دسته تقسیم می کنند. فیلترهای long pass به امواجی با طول موج های بالاتر از حد مورد نظر اجازه عبور می دهند در حالی که فیلترهای short pass به امواجی با طول موج های پایین تر اجازه عبور می دهند.
دسته سوم، فیلترهای band pass هستند که تنها امواجی با طول موج مخصوص و در یک طیف باریک از آن ها عبور می کنند. همه این فیلترها از طریق مکانیسم جذب نور از عبور نور جلوگیری می کنند.
زمانی که فیلتر با زاویه 45 درجه در مسیر پرتو نور ورودی قرار می گیرد، حالت دوگانه آینه و فیلتر به خود می گیرد. در چنین شرایطی فیلتر دو عمل انجام می دهد. اول اینکه امواج با طول موج مورد نظر را در جهت مستقیم از خود عبور می دهد و دوم اینکه امواج نور ناخواسته را با زاویه 90 درجه نسبت به زاویه تابش اولیه منعکس و منحرف میکند. برای تشخیص چندین سیگنال به طور همزمان، سفارش و انتخاب دقیق فیلترها امری بسیار مهم و ضروری است.
پردازش سیگنال
برخورد اشعه نور به فوتو دتکتور، موجب ایجاد جریان الکتریکی ضعیفی در حد میکرو آمپر می شود که ولتاژ آن با تعداد کل فوتون های نوری دریافت شده بوسیله فوتودتکتور تناسب دارد. این ولتاژ سپس به وسیله یک سری آمپلی فایرهای خطی یا لگارتیمی تقویت شده و از طـریق مبدل های دیجیتال آنالوگ به جریان ها و سیگنال های الکتریکی در حدی که به صورت گرافیکی قابل رسم باشند (10 -5 ولت)، تبدیل می شوند.
تقویت لگاریتمی معمولا به منظور مطالعات فلورسانس استفاده می شود، زیرا این روش سیگنال های ضعیف را تقویت کرده و سیگنال های قوی را متراکم و فشرده می کند. در نتیجه منجر به توزیع شده و به راحتی بر روی هستیوگرام قابل مشاهده خواهد بود. اما در مواردی مانند آنالیز DNA که طیف وسیعی از سیگنال ها وجود دارد استفاده از روش مقیاس گذاری خطی مناسب تر است.
مقادیر به دست آمده از هر دتکتور به عنوان یک پارامتر در نظر گرفته می شود. به عنوان مثال تابش مستقیم، تابش جانبی یا فلورسانس. اطلاعات مورد نیاز هر پارامتر به عنوان یک رویداد شناخته شده و به تعداد سلول هایی که یک مشخصه فیزیکی را بیان می کنند و یا مرتبط با مارکر مورد نظر می باشند؛ بستگی دارد.
در انتها توسط یک برنامه خاص نمودارهای لازم و مرتبط رسم می شوند و در اختیار کاربر قرار می گیرند.
مطالب مرتبط:
منبع1
