فوتوبلیچینگ در میکروسکوپ فلورسانس چیست؟
فوتوبلیچینگ پدیده‌ای است که فلوروفور، فلورسانس خود را به دلیل آسیب ناشی از نور از دست می‌دهد که منجر به از دست دادن فلورسانس و سیگنال در هنگام تصویربرداری از نمونه می‌شود.
اصول کار
هنگامی که نور با طول موج مناسب به فلوروفور هدایت می‌شود، از حالت پایه تغییر می‌کند و به صورت برانگیخته می‌شود. در حالت برانگیخته خود، ممکن است با مولکول‌های دیگر برهمکنش داشته باشد و دائم تحت تغییرات کووالانسی قرار گیرد. همچنین، حالت برانگیخته در مقایسه با مرحله پایه، طولانی مدت است که آن را مستعد برهمکنش با سایر مولکول‌ها می‌کند. تعداد کل این چرخه‌ها برای هر مولکول فلورسنت به ساختار و محیط اطراف آن بستگی دارد. بر اساس این پارامترها، برخی از فلوروفورها می‌توانند به سرعت سفید شوند، در حالی که برخی دیگر می‌توانند چندین هزار چرخه را قبل از سفید شدن پشت سر بگذارند.
روش‌های کاهش فوتوبلیچینگ
کاهش شدت نور
کاهش شدت نور می‌تواند قرار گرفتن فلوروفورها در معرض نور را کاهش دهد و در نتیجه چرخه‌های برانگیختگی را کاهش دهد که در نهایت باعث کاهش فوتوبلیچینگ مرتبط با آن می‌شود. با این حال، کاهش شدت نور می‌تواند شدت سیگنال را نیز کاهش دهد. بنابراین، باید تعادل صحیحی بین دستیابی به شدت سیگنال مناسب و حداقل فوتوبلیچینگ ایجاد شود.
کاهش زمان قرار گرفتن در معرض نور
روش دیگری برای کاهش اثر سفید کننده نور است. در این حالت، کاهش زمان قرار گرفتن در معرض نور، تعداد دفعاتی را که فلوروفورها تحت چرخه‌های برانگیختگی قرار می‌گیرند، کاهش می‌دهد و در نتیجه سفید کردن را کاهش می‌دهد. این را می‌توان با کاهش سکون پیکسل نور لیزر یا تثبیت نرخ فریم بر ثانیه تصویربرداری سریعتر به دست آورد. روش دیگر محدود کردن منطقه تصویربرداری است که می‌توان با تثبیت یک ناحیه کوچک و پس از تصویربرداری از آن ناحیه، حرکت به ناحیه مجاور را به دست آورد.
افزودن آنتی فایدها
آنتی فایدها معرف‌های تجاری موجود هستند که می‌توانند اثر سفید کننده نور را کاهش دهند و بعد از تمام مراحل ایمونوسیتوشیمی در مرحله آخر قبل از تصویربرداری استفاده می‌شوند. معرف‌های متفاوتی در دسترس هستند که می‌توان آنها را آزمایش کرد تا بهترین معرف با اثر بهینه برای نمونه مورد نظر شناسایی شود.
استفاده از رنگ متفاوت
رنگها یا فلوروفورهای مختلف دارای خواص سفیدکننده نوری متفاوتی هستند. به عنوان مثال، پروتئین‌های فلورسنت قرمز در مقایسه با پروتئین‌های فلورسنت سبز، به سفید کردن نور حساس‌تر هستند. بنابراین، تغییر رنگ انتخابی و استفاده از رنگی که پایدارتر باشد نیز می‌تواند برای کاهش فتوبلیچینگ نمونه به کار گرفته شود.
استفاده از فیلترهای با چگالی خنثی
استفاده از فیلترهای چگالی خنثی می‌تواند نور یا اعداد فوتون تابیده شده بر روی نمونه را کاهش دهد. همچنین می‌تواند قرار گرفتن نمونه در مقابل نور را کاهش و سیگنال نمونه را نیز کاهش دهد.
یکی از روش‌های غلبه بر این مسئله، افزایش تابع بهره مولتی‌پلایر نوری است. با این حال، افزایش این عملکرد باعث افزایش نویز در کنار سیگنال‌های تصویر نیز می‌شود. بنابراین، تعادل مناسبی بین نسبت سیگنال به نویز و سفیدکننده نور باید به دست آید تا بهترین تصویر به دست آید.
کاربردهای فوتوبلیچینگ
اتوفلورسانس پدیده‌ای است که نمونه حاوی اجسام سلولی است که به دلیل فلوروفورهای درون‌زا به طور طبیعی فلورسنت هستند. این بافت یا اندامک‌ها اغلب در طول موج‌های مشابه فلوروفورهای معمول استفاده می‌شوند، مانند پروتئین فلورسنت سبز (GFP) یا فلورسئین ایزوتیوسیانات (FITC) که این پدیده باعث افزایش خطا در تمایز بین سیگنال واقعی و سیگنال از فلوروفورهای درون‌زا می‌شود. در چنین مواردی می‌توان از فوتوبلیچینگ به عنوان یک ابزار استفاده کرد.
تصویر را می‌توان به مدت دو ساعت در معرض اشعه ماوراء بنفش قرار داد تا فلوروفورهای درون‌زا سفید شود و سپس نمونه با پروتئین‌های فلورسنت مخصوص نور مناسب مانند GFP تصویربرداری شود تا اثر اتوفلورسانس کاهش یابد.
همچنین بخوانید:
- ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری
- تکنیک ایمونوفلورسانس چیست؟ اصول و روش
- آشنایی کامل با انواع میکروسکوپ
مترجم: معصومه قریبی ششده
